Synevo Молдова С-генотипизиращ вирус на хепатит
Обща информация и препоръки
Подобно на други РНК вируси, HCV има на нуклеотидно ниво значително генетично разнообразие, генерирано от високата степен на вирусни мутации. За да се структурира това генетично разнообразие по определен начин, бе формулирана класификация на HCV в 6 генотипа (наречени 1, 2, 3, 4, 5, 6) въз основа на филогенетичния анализ на геномната последователност. Всеки генотип от своя страна е филогенетично подразделен на един или повече подтипове (наречени a, b, c и т.н.). Тези имена станаха стандартна система за новата номенклатура на генотипове на HCV 10; 11. Освен това заразените с HCV хора циркулират и се държат като смесица от различни вирусни популации, наречени квазивидове.
6-те основни генетични типа се различават един от друг по нуклеотидни последователности в съотношение 30-35%; между подтиповете има разлика от 20-25%, а в рамките на същия подтип разлика до 10%.
Геномът на HCV се състои от домейни, които се различават значително по скоростта на мутациите и вариабилността на нуклеотидните последователности. По този начин нетранслираният регион в 5 'края на генома (5'UTR) е най-добре запазеният домейн, с най-бавна еволюционна скорост. След това следва гена C (сърцевина), който кодира ядрото на протеина нуклеокапсид и който се развива три пъти по-бързо в сравнение с 5'UTR региона. Гените, кодиращи протеините на обвивката E1 и E2, представляват хипервариабилната област, която се различава от един изолат до друг. Това позволява на вируса да заобиколи имунните механизми на гостоприемника, насочени срещу достъпни протеини във вирусната обвивка.
Генотиповете и подтиповете на HCV представят сложни модели на географско разпространение, относително разпространение и начини на предаване на инфекцията, които могат да бъдат по-добре разбрани, ако се класифицират в три групи:
1. Епидемичната група включва подтипове 1a, 1b, 2a, 2b и 3a, които имат глобално разпространение и са отговорни за повечето инфекции в световен мащаб. Бързото разпространение на тези подтипове в световен мащаб е резултат от ефективното им предаване чрез заразени кръвни продукти и прилагането на интравенозни лекарства. Подтипове 1b и 2a са свързани предимно с предаване чрез кръвни продукти и тяхното относително разпространение е намаляло през последните години поради подобрения скрининг на донори. Подтипове 1а и 3а се срещат главно при наркомани и тяхното разпространение се увеличава.
2. ендемичната група има по-ниско разпространение от епидемичната група, ограничена до определени региони. Например, подтипове генотип 6 се срещат само в Югоизточна Азия. Много високото генетично разнообразие на ендемичните щамове предполага дългосрочно персистиране на инфекцията в тези региони поради поддържането на относително неефективни начини на предаване, включително сексуални.
3. Местната епидемична група има голямо разпространение в определени региони и популации на земното кълбо. По този начин подтип 4а е отговорен за заразяване на повече от 10% от населението на Египет и рядко се среща извън Близкия изток. Епидемиологичните проучвания предполагат, че това явление се е случило през ХХ век, по време на масовото интравенозно приложение на лекарства срещу шистосомоза 11 .
У нас преобладават генотип 1b и смес от генотипове 1a и 1b 4. Неотдавнашно проучване, проведено в института Matei Bals в Букурещ върху 670 пациенти, показа 99,7% разпространение на HCV генотип 16 .
Познаването на вирусния генотип предоставя прогностична информация за ефикасността на терапията при пациенти с хроничен HCV вирусен хепатит. Например, генотип 1b (най-често придобит след трансфузия) е свързан с лош отговор на лечението и повишен риск от цироза и хепатоцелуларен карцином. От друга страна, генотипове 2 и 3 (придобити предимно чрез i.v. употреба на наркотици) са свързани с благоприятен отговор на антивирусната терапия 7; 8; 9 .
Американският национален здравен институт (NIH) показа през 2002 г., че определянето на генотиповете на HCV е важно при избора на оптимални дози интерферон и рибавирин, както и продължителността на лечението. По този начин при пациенти с див тип генотип 1 се препоръчва продължителност на лечението от 48 седмици, а за пациенти с генотип 2 и 3 продължителност от 24 седмици с по-ниски дози рибавирин. Полезно е генотипирането на HCV да се извършва при всички инфекции с вирус C, преди да започне каквото и да е лечение 1 .
Тестът, извършен в нашата лаборатория, използва PCR техника за усилване на някои области на генома на HCV, последвана от обратна хибридизация за идентифициране на HCV генотипове 1 до 6 и подтипове а и b на генотип 1 5 .
Регион 5'UTR представя множество последователности, специфични за всеки генотип, разпределени по 7 малки променливи области, които могат да дадат точна информация за генотипове 1-5 и подтипове а и b на генотип 6. Поради голямото последователно сходство, субклипове cl от генотип 6 ( класифицирани преди като 7, 8, 9 и 11) не могат да бъдат разграничени от генотип 1 само чрез анализ на 5'UTR региона. Точността на идентифициране на подтипове 1a и 1b чрез анализ на 5'UTR региона е между 80% и 95% и зависи от специфичните тествани изолати 3. Нашият тест използва последователности на основния регион във връзка с 5'UTR региона за идентифициране на подтипове на генотип 6, c-1. За да се подобри точността на идентифицирането на подтипа 1a и 1b, са включени допълнителни генни последователности на ядрото. .
Обучение на пациента - не се изисква специално обучение 5 .
Събран образец - кръвта ще дойде 5 .
Контейнер за прибиране на реколтата - вакуутан, съдържащ EDTA като антикоагулант 5 .
Количество реколта - колкото вакуумът позволява 5 .
Причини за отхвърляне да опиташ - използване на хепарин като антикоагулант; коагулирани или хемолизирани проби 5 .
Тествайте стабилността - EDTA кръвта е стабилна 48 часа при 2-8ºC 5 .
Метод - реакция на верижна полимеризация, последвана от обратна хибридизация; биотинилираният амплификационен продукт претърпява хибридизационен процес, използвайки олигонуклеотидни сонди, специфични за 5'UTR и ядрени области на различни HCV генотипове, фиксирани върху нитроцелулозна лента; след етапа на хибридизация се добавя конюгатът (белязан с алкална фосфатаза стрептавидин), който ще се прикрепи към биотинилирания хибрид; добавеният хромогенен субстрат в крайна сметка ще реагира с алкалния стрепатвидин-фосфатазен комплекс и ще генерира кафяво-лилава утайка, която ще се визуализира като лентови ленти; интерпретацията на резултатите се извършва с помощта на карта 5 .
Граници и смущения
HCV генотипирането не се препоръчва за скрининг или потвърждаване на HCV инфекция. Тестът е възможен само в случай на C> 600 IU/mL виремия.
В някои случаи могат да се получат неразбираеми резултати поради хетерогенността на HCV геномните последователности, смесените инфекции или (рядкото) съществуване на рекомбинантни HCV щамове 5 .
1. Практически указания за AASLD http: /www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C
2. Консенсусна конференция Лечение на хепатит C. Maison de la Chimie, Париж, Франция, 27 - 28 февруари 2002 г. Agence Nationale d ”Accreditation et d” Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Генотипизиране на вируса на хепатит С: разпитът на 5 ’нетранслирания регион не може точно да разграничи генотипове 1а и 1b. В J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127-3344.
4. Илеана Константинеску, Клиничен институт Фундени. Генотипизиране на вируси на хепатит в Румъния. Симпозиум юни 2008 г., Tg. Муреш: Ролята на техниките за молекулярна биология при изясняване на механизмите на инфекция с вируса на хепатит С, както и при откриването на нови маркери за фиброза и хепатоцелуларен карцином, свързани с тази инфекция.
. 5. Лаборатория Синево. Специфични препратки към използваната технология на работа. 2009. Ref Ref: Каталог.
6. Неага Емил. Разпространение на HCV генотип 1 в Румъния. Симпозиум юни 2008 г., Tg. Муреш: Ролята на техниките за молекулярна биология при изясняване на механизмите на инфекция с вируса на хепатит С, както и при откриването на нови маркери за фиброза и хепатоцелуларен карцином, свързани с тази инфекция.
7. Nguyen MH, Keeffe EB. Разпространение и лечение на генотипове на вируса на хепатит С 4,5 и 6. В Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 10: S97 - S101.
8. Pawlotsky JM. Генетична вариабилност на вируса на хепатит С: патогенни и клинични последици. В Clin Liver Dis. 2003; 7; 45 - 66.
9. Seeff LB, Hoofnagle JH Приложение: Конференция за развитие на консенсуса на Националния институт по здравеопазване: Управление на хепатит С 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7: 261-287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C et al. Предложения за консенсус за единна система от номенклатура на генотипите на вируса на хепатит С. В Хепатол. 2005; 42; 962 - 973.