Състав на тялото и анализ на метаболитната клетка в протокол за мишки с високо съдържание на мазнини (преведено на немски)

Обобщение

Този протокол описва използването на анализ на телесния състав и система за мониторинг на метаболизма на животните за характеризиране на телесния състав и метаболитните параметри при мишки. Модел на затлъстяване, предизвикан от хранене с високо съдържание на мазнини, служи като пример за прилагането на тези техники.

Резюме

Промените в телесния състав (мазнини или слаба маса), метаболитните параметри като консумация на кислород в цялото тяло, разход на енергия и използване на субстрата и поведение като прием на храна и физическа активност могат да предоставят важна информация относно основните механизми на заболяването. Като се има предвид значението на телесния състав и метаболизма, развитието на затлъстяването и последващите последствия от него, е необходимо да се вземат точни мерки за тези параметри в предклиничните изследвания. Напредъкът в технологиите през последните няколко десетилетия позволи тези мерки да бъдат извлечени в модели на гризачи по неинвазивен и надлъжен начин. В резултат на това тези метаболитни мерки се оказаха полезни при оценка на отговора на генетични манипулации (напр. Нокаут или трансгенни мишки, вирусен нокдаун или свръхекспресия на гени), експериментален скрининг на лекарство/съединение и диетична, поведенческа или физическа активност Интервенции. Тук описваме протоколите за измерване на телесния състав и метаболитните параметри с помощта на система за наблюдение на животни при мишки, хранени с чау и с високо съдържание на мазнини.

Въведение

Много аспекти на нормалната клетъчна, органна и физиология на цялото тяло подкрепят метаболизма. В резултат на това в условията на различни заболявания промените в метаболизма могат да допринесат пряко за основното заболяване или да бъдат компрометирани като страничен ефект от патологията. Традиционно метаболитните изследвания и проучванията в енергийния баланс се фокусират върху областта на затлъстяването и свързаните с него състояния като инсулинова резистентност, преддиабет, непоносимост към глюкоза, сърдечно-съдови заболявания и диабет. Това изследване е оправдано в светлината на нарастващото разпространение на подобни условия в световен мащаб и на индивидуалните, социалните и икономическите разходи, които тези условия причиняват. По този начин разработването на стратегии за превенция и нови терапевтични средства за насочване на затлъстяването е постоянна цел в изследователските лаборатории по света и за тези проучвания се използват силно предклинични модели на мишки.

В този протокол ние предоставяме пряко описание на използването на анализ на телесния състав за оценка на телесния състав при мишки и система за метаболитно наблюдение на животни за измерване на аспекти на метаболизма. Съображенията и ограниченията за тези техники се обсъждат заедно с предложените методи за анализ, интерпретация и представяне на данните.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички описани експерименти са одобрени от Комитета по етика на животните на Alfred Medical Research Education AMC (AMREP AEC) и за мишките се грижат хуманно в съответствие с насоките на Националния съвет за здравни и медицински изследвания (NHMRC) в Австралия относно изпитванията върху животни. Животните получават предписаната им диета и вода ad libitum и се намират в среда с контролирана температура (

21-22 ° C) с лек 12 h и 12 h тъмен цикъл. Седемседмични мъжки мишки (на фона на C57Bl/6J) или са били редовно хранени с нормална чау-диета (енергийно съдържание 14,3 MJ/kg, състоящо се от 76% от kJ от въглехидрати, 5% мазнини, 19% протеини; Материали) или за групата с високо съдържание на мазнини, диета с високо съдържание на мазнини (HFD) () енергийно съдържание 19 MJ/kg, състояща се от 36% въглехидрати, 43% мазнини, 21% протеин, специални храни kJ) за 3 седмици. Съставът на телесното тегло и височината с машина EchoMRI се правеха ежеседмично, докато мониторинг на метаболитния анализ в мида беше направен след 3 седмици диета.

(1) Процедура на анализатора на състава на тялото

Забележка: За да функционира оптимално, използваният в този протокол EchoMRI 4-в-1 трябва да се съхранява в помещение, където температурата на въздуха е стабилна и не се колебае. В идеалния случай това трябва да се наблюдава постоянно. За да преминете към захранване на машината, трябва да се избягват прекъсвания, ако е възможно. Ако захранването е прекъснато и системата трябва да се рестартира, изчакайте поне 2-3 часа, за да загрее машината, преди да я използвате отново. Преди да започнете, уверете се, че носите подходящи лични предпазни средства.

2. Мониторинг на процедурата за метаболитна система при животни

Забележка: Системата изисква

2 часа за загряване и стабилизиране. Когато машината е изключена, тя трябва да се включи, за да може клетката на циркониевия оксид да се нагрее до 725 ° С. Също така, обикновено поставяме мишки в анализатора на телесния състав един ден преди влизане в животното, системата за наблюдение, проблеми с Нежелание да се избягва стресът.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Резултатите на фигура 3 може да се види, че показва типична промяна в параметрите на телесния състав при хранене с високо съдържание на мазнини, измерено чрез EchoMRI. В началото няма разлика в нито един измерен параметър (Фиг. 3А-F.). Въпреки това, само след 1 седмица хранене с високо съдържание на мазнини, имаше значително увеличение на телесното тегло, мастната маса и процентното съдържание на мазнини в групата с HFD (Фиг. 3А,Б.,Д.). Степента на разликите между двете групи за тези мерки продължи да нараства през 3-седмичната диетична интервенция. Мускулна маса, свободна вода и общо водно съдържание (Фигура 3,Д.,F.) не правят разлика между групите в нито един момент от времето. Също така може да се види, че мишките Chow продължават да напълняват през периода на изследване (Фигура 3А) хранени, това е увеличение на чистата маса (Фигура 3), вместо да увеличава мастната маса (фиг. 3 b).

RER е значително по-нисък при мишките с високо съдържание на мазнини, което показва използване на мазнини в сравнение с използването на въглехидрати, когато диетата с високо съдържание на мазнини (фиг. 5А) хранени. Потреблението на енергия (топлина) без нормализиране става по-тежко животно, вероятно поради по-метаболитно активната тъкан на животните (Фиг. 5b), с тази разлика, загубена след нормализиране на телесното тегло (Фигура 5) повишен. Също така обърнете внимание на увеличенията на VO2, RER и енергийните разходи в тъмния цикъл в сравнение със светлинния цикъл, когато мишките са по-активни. Тези разлики представляват класическите ежедневни промени в метаболизма, които се случват при мишки. Докато в този пример сме разделили данните на 12-часови блокове, разделянето на данните на по-малки времеви епохи също може да бъде полезно. Физическата активност също е фактор, който допринася за разхода на енергия. Те не се различават между групите, което предполага, че намаляването на упражненията не е двигател на фенотипа със затлъстяване при мишките с високо съдържание на мазнини (Фигура 5).

статистика

Всички данни в този документ са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистическата значимост продължава при p Фигура 1 : Правилно разположение на разходите за мишки и притежателите на проби от малки животни с мишки в рамките на анализа на тялото на състава. Извършете системно изпитване със стандартно калибриране (цена) или за сканиране на мишки в държача за проби от малки животни, всеки в порталната система. Червените стрелки показват цилиндъра, в който мишките ще се съдържат в хипостилната зала на машината.

тялото

Фигура 2 : Сглобяване на отделните камери. (А) поставете контейнера за храна в средата на кантара. Б) поставете платформата във всяка камера и поставете камерата над фунията. ° С) Мишките в камерите поотделно и се покриват. Д) поставете и закрепете бутилката с вода.

състав

Фигура 3 : Анализ на тялото на телесния състав за 3 седмици диета с високо съдържание на мазнини. (А) телесно тегло, (Б) Мастна маса, (° С) отхвърли тълпата, (Д) Масова фракция на мазнините, (E) Съдържание на вода, безплатно и (F) Общо водно съдържание. Кръговете представляват нормални диети с чау, квадратите - HFD. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

клетка

Фигура 4 : Метаболитни параметри, получени от метаболитна система за наблюдение на животни след 3 седмици от съответните диети. Мишките бяха настанени в камерите в продължение на 48 часа с първите 24 часа като индукция. Данните от втория 24 h бяха анализирани и представени в тези числа. (А) Сурови цени на VO2, Б) VO2 нормализиран спрямо телесното тегло (° С) VO2 нормализиран до мускулна маса, (Д) Разпръснат график за некоригирано VO2 (общо 24 часа) телесно тегло, t и (E) некоригирана VO2 чиста телесна маса. A-C Белите ленти представляват нормална диета с чау, черните ленти представляват диета с високо съдържание на мазнини. D-E Кръговете представляват нормални диети с чау, квадратите представляват HFD. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

клетка

Фигура 5 : A) Съотношение на дихателната обмяна (RER), (Б) Топлина (консумация на енергия) и (° С) Топлината се нормализира до телесното тегло. Д) Ниво на активност, изчислено като сбор от амбулаторния X и Y лъч, прекъсвания и Z лъчи прекъсвания. Белите ленти представляват нормална чау диета; черните ленти представляват HFD.


Фигура 6 : Данни за прием на храна в системата за последните 24 часа. (А) Прием на храна в грамове, (Б) Приемът на храна се нормализира до телесното тегло и (° С) изчислено потребление на енергия. n = 4-5 (3 мишки бяха изключени поради голяма бъркотия с храната). Белите ленти представляват нормална чау диета; черните ленти представляват HFD. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Важни стъпки

Описаните тук протоколи ви дават пример за измерване на телесния състав и различни метаболитни параметри при мишки, като се използва анализ на телесния състав и система за наблюдение на метаболизма на животни. И за двете техники е от решаващо значение да се гарантира, че машините работят оптимално и за да се направи това, наложително е изследователят да извърши анализ на физическия състав на тялото и да е калибриран върху известен газов състав за метаболитната система за наблюдение на животните на оборудването. Това дава по-голяма последователност в резултатите и възможност за идентифициране на потенциални проблеми с машината.

Модификации и корекции на грешки

ограничения

Бъдещи приложения

Докато в този пост ние използвахме затлъстяването, придобити чрез хранене с високо съдържание на мазнини, като пример за болестно състояние, при което измерването на телесния състав и метаболитните параметри са полезни, използването на тези устройства далеч не е ограничено до тази област на изследване. Използването на тези техники е ценно и при изучаване на заболявания като диабет, сърдечно-съдови заболявания, свързана с възрастта саркопения, немощ, ракова кахексия, мускулна дистрофия и липодистрофия. Въпреки че първоначалните разходи за придобиване на такава инфраструктура са значителни, възможността за използване на устройството в множество и различни области на медицинските изследвания смекчава тези първоначални разходи. Освен това текущите разходи за реагент и консумативи за тези машини са минимални; Превантивната поддръжка и обслужване обаче трябва да бъдат обмислени и предвидени в бюджета.

Методите, описани в тази статия, могат да се използват за характеризиране на телесния състав и различни метаболитни параметри при мишки. Тези мерки се прилагат за голям брой изследователски области и предоставят важна информация за характеризиране на фенотип. Данните от тези методи могат също да сочат към основните механизми, които движат определен метаболитен фенотип. По-нататъшното развитие и усъвършенстване на тези технологии позволява на изследователите да прогресират своите открития към терапевтични резултати.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.