Разделящи протеини за масова спектроскопия - LABO ONLINE
Отделни протеини за масова спектроскопия
Една проста оценка се превръща в множество измервания
Двуизмерната капилярна електрофореза дава възможност за онлайн характеризиране на протеини, разделени чрез гел електрофореза, използвайки масспектрометрия. Този метод е описан от авторите в статията им за LABO.
Гелната електрофореза за разделяне на белтъците според техния размер е въведена преди 50 години [1] и се е превърнала в най-широко използваната по рода си техника за разделяне. Натриевият додецил сулфат (SDS), който образува комплекс с протеините, се добавя към протеина или протеиновата смес, която трябва да се анализира. Полученият отрицателен заряд на SDS-протеиновия комплекс покрива вътрешния заряд на протеина и е пропорционален на размера на протеина. В резултат на това, при подобни съотношения на заряд към маса, комплексите теоретично се разделят само въз основа на техния размер в електрическо поле от сепариращ гел, обикновено полиакриламиден гел (PAGE). Чрез сравняване на миграцията на протеините, които трябва да бъдат анализирани, с миграцията на протеини с известни маси, неизвестната маса може да бъде оценена чрез екстраполация. SDS-PAGE се използва за определяне на протеинови маси и за разделяне на сложни протеинови смеси въз основа на техния размер.
Поради относително високите лабораторни и времеви разходи, тази техника за анализ беше оптимизирана, така че разделянето вече не се извършва в разделително легло, а в капиляр от кварцово стъкло (CE (SDS)). Този капиляр има вътрешен диаметър предимно 50 µm и е запълнен с отделящ гел буфер. Това се различава от разделящия гел, който обикновено се използва в SDS-PAGE, по това, че се използват водоразтворими линейни или само леко омрежени полимери (вместо омрежени полимери), за да може да се обменя разделящият гел буфер в капиляра [2]. По този начин отделянето в капиляра може да бъде автоматизирано и възпроизводимостта се увеличава. Друго важно предимство на разделянето в капиляра е онлайн откриването чрез ултравиолетова абсорбция или флуоресценция.Това дава възможност да се правят количествени изявления и отнемащите време фиксиране и оцветяване на отделените протеини, както при SDS-PAGE, вече не са необходими.
Теми в статията
CE (SDS) се използва широко в биофармацевтичната индустрия за тестване и характеризиране на чистотата и продуктите от разграждането на терапевтичните протеини като антитела. Следователно фокусът на анализа е отделянето и количественото определяне на възникналите фрагменти. Идентифицирането на тези фрагменти е друг важен момент, тъй като те могат да повлияят на ефективността на терапевтичния протеин и по този начин безопасността на пациента.
Неточно определяне на масата чрез екстраполация
Идентификацията се оказва огромно предизвикателство. Тъй като ефективността на разделяне на CE (SDS) често не е достатъчна, това може да доведе до скриване на няколко фрагмента зад връх. Това прави определянето на пикове на фрагменти чрез експерименти с добавяне на пикове (добавяне на фрагменти, които вече са идентифицирани и наблюдение на увеличаване на площта на пика) е по-трудно. Идентифицирането с помощта на изчислената протеинова маса чрез екстраполация също не е възможно. Тъй като независимо дали разделянето на протеините на SDS се извършва в капиляра или в полимеризирания гел, определянето на масата е неточно. В допълнение, съотношението на свързания SDS към протеина може да се различава в зависимост от последователността и структурата на протеина, което означава, че специфичната маса може да се отклонява още повече от реалната маса [3 - 4].
Неточното определяне на масата не позволява ясно идентифициране на примесите. Чрез определяне на точната маса на тези фрагменти с помощта на масспектрометрия (MS), обаче е възможна идентификация. За съжаление директното свързване на CE (SDS) не е възможно, тъй като силно вискозният отделящ гел буфер съдържа декстран и нелетливи компоненти като борат - но преди всичко повърхностноактивното вещество SDS, което води до пълно потискане на протеина в процеса на йонизация [5]. Подобряване на този метод на СЕ (SDS) за евентуално събиране на фракции с последваща офлайн подготовка на пробата по отношение на съвместимостта с МС не е възможно поради малките обеми и силно вискозния отделящ гел буфер.
Онлайн масспектрометрия чрез двумерна капилярна електрофореза
Нашият подход за онлайн свързване на MS се основава на превключване на второ измерение на разделяне под формата на електрофореза на капилярната зона (CZE) между разделяне на CE (SDS) и MS (фиг. 1а) [6]. Това позволява несъвместимите с MS компоненти да бъдат отделени от аналита. За да се реши много стабилният SDS-протеинов комплекс, необходим за предишното разделяне, е необходима допълнителна обработка на пробата. За това декомплексиране на SDS-протеиновия комплекс е разработена онлайн стратегия във второто измерение на разделяне. Това се състои от съвместно инжектиране на органичен разтворител (тук метанол) и катионно повърхностно активно вещество (тук цетилтриметиламониев бромид (CTAB)), което е разположено преди или след протеиновия комплекс SDS в капиляра на второто разделящо измерение.
Свързването на общото разделяне CE (SDS) в първото разделително измерение с CZE във второто разделително измерение се осъществява чрез нанолитров клапан с четири връзки (VICI). С този клапан е възможно да се подаде високо напрежение (до около 15 kV), което е необходимо за разделянето. Вътрешен контур за проби в диапазона от нанолитри (4, 10 или 20 nl) позволява тези много малки обеми да бъдат прехвърлени от едно измерение в друго.
Измерването на фрагменти от непокътнато, термично напрегнато антитяло с двумерната система за капилярна електрофореза е показано на фигура 2. Беше възможно да се генерират масови спектри и на двата пика в измерението CE (SDS). Стана очевидно, че под всеки пик на CE (SDS) е скрит не само един, но няколко фрагмента. За пик 1 (фиг. 2, синьо), фрагмент 1С (23439,4 ± 1,5 Da) може да бъде присвоен на леката верига на антитялото. Фрагментът 1В с разлика в масата от 103,7 Da към леката верига 1С може да се дължи на С-терминално разцепване на цистеина и 1А на допълнително елиминиране на водата. За втория пик на СЕ (SDS) (фиг. 2, зелено) също имаше три фрагмента на антитела. Масата на пик 2С от 47638,2 ± 0,7 Da беше идентифицирана като Fab фрагмент. Елиминирането на последните две (T-H, ∆M = 238,2 Da) или три аминокиселини (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) с елиминиране на вода от този Fab фрагмент води до масови пикове 2B и 2A.
Заключение и перспективи
С двуизмерния метод на капилярна електрофореза, представен тук, е възможно да се получат онлайн масспектри на предварително отделени от СЕ (SDS) протеини без допълнителна подготовка на пробата. С точните размери е възможно да се идентифицират замърсителите в биофармацевтичните продукти и да се подпомогне оптимизацията на процеса за производството на съответните лекарства.
Литература:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] Zhu et al. Anal Chim Acta. 2012, 709, 21-31.
[3] Guan et al. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Rundlett et al. Anal Chem 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Römer et al. Anal Bioanal Chem 2019, 411 (27), 7197-7206.
АВТОРИ
Дженифър Ромър 1
Кристина Монтеалегре 1
Бернд Мориц 2
Стефен Кисиg 2
Кристиан Нойсюс 1
1 Университет Аален, катедра по химия
2 F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Базел, Швейцария