Подготовка на протокол за качествен инозитол пирофосфати (преведен на немски)

Обобщение

Инозитол пирофосфатите играят важна роля при човешки заболявания като рак, диабет и затлъстяване, но точният механизъм на действие е противоречив. Липсата на налични в търговската мрежа инозитол пирофосфати прави подробни проучвания проблематични. Тук ние описваме прост протокол за получаване и изолиране на милиграми инозитол пирофосфат.

Резюме

Мио-инозитолът се среща естествено или непроменен, или в по-сложни фосфорилирани производни. Двете най-често срещани в еукариотните клетки са инозитол пентакисфосфат (IP 5) и инозитол хексакисфосфат (фитинова киселина или IP 6). IP 5 и IP 6 са предшествениците на инозитол пирофосфатни молекули, които съдържат една или повече пирофосфатни връзки 1. Фосфорилирането на IP 6 произвежда дифосхоинозитол пентакисфосфат (IP 7 или PP-IP 5) и бисдифосхоинозитол тетракисфосфат (IP 8 или (PP) 2-IP 4). Досега са изследвани инозитолови пирофосфати от всички еукариотни организми. В допълнение, двата различни класа ензими, отговорни за синтеза на инозитол пирофосфат, са силно запазени по време на еволюцията 2-4.

IP 6 киназите (IP 6 Ks) имат огромна каталитична гъвкавост, превръщайки IP 5 и IP 6 в PP-IP 4 и IP 7 съответно и след това, като използват тези продукти като субстрати, насърчавайки генерирането на сложни молекули 5, 6. Наскоро беше идентифициран втори клас ензими, произвеждащи пирофосфати, под формата на дрожден протеин VIP 1 (известен също като PP-IP 5K), който може да преобразува IP 6 в IP 7 и IP 8 7,8.

Инозитол пирофосфатите регулират много различни клетъчни процеси като инсулинова секреция 9, дължина на теломерите 10.11, хемотаксис 12, трафикулиране на везикули 13, хомеостаза на фосфати 14 и освобождаване на ХИВ-1 на кръста 15. Предложени са два механизма на действие за този клас молекули. Те могат алостерично да повлияят на клетъчната функция, като взаимодействат с определени протеини като AKT 16. Алтернативно, пирофосфатната група може да дари фосфат на фосфорилирани протеини 17. Огромният потенциал на тази изследователска област е затруднена от липсата на търговски източник на инозитол пирофосфати, което пречи на много учени да изучават тези молекули и да правят тази нова пост-транслационна модификация. Наличните в момента методи за изолиране на инозитол пирофосфати изискват сложен хроматографски апарат 18,19. Тези процедури се възползват от киселинни условия, които могат да доведат до разграждане на инозитол пирофосфат и по този начин до лошо възстановяване. Също така, тромавите процедури за обезсоляване след колони ограничават използването им до специализирани лаборатории.

В това проучване ние описваме неизискващ метод за генериране, изолиране и пречистване на продуктите от реакциите IP 6-киназа и PP-IP 5-киназа. Този метод стана възможен благодарение на способността на полиакриламидната гел електрофореза (PAGE) да разтваря силно фосфорилирани инозитолови полифосфати 20. След IP 6 K1 и PP-IP 5 K ензимни реакции, използващи IP 6 като субстрат, PAGE се използва за отделяне на генерираните инозитол пирофосфати, които впоследствие се елуират във вода.

Протокол

1. Ензимна реакция - ден 1 (1 час следобед)

  1. Първата стъпка е да се подготвят 10-20 независими ензимни реакции, при които IP 6 K1 или VIP1 преобразуват IP 6, пирофосфорилираните изоформи.
  2. Използваме ензими His-IP 6 K1 и GST-VIP1, пречистени от Е. coli съгласно протокола, описан по-рано 17,18.
  3. Пригответе 50 μl реакции с 1x реакционен буфер (30 mM Hepes pH 6.8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM фосфокреатин (PCr), 25 U/mL креатин фосфокиназа (CPK), 5 mM ATP (Mg сол), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 µg His-IP 6 K1 или GST-VIP1. Регулиране на силата на звука с MiliQ ddH 2 O.
  4. За кратко завъртете реакцията и при 37 ° С една нощ с въртене.

2. Изливане и зареждане с полиакриламиден гел - Ден 2 (4 часа следобед)

  1. Полиакриламидният гел е направен с помощта на 24 cm дълги, 18 cm широки стъклени плочи и 1,5 mm широки дистанционни елементи. Обикновено се използва 16 ленти или подготвителен гребен с една лента.
  2. Пригответе смес (50 ml/гел) със следното съдържание: 35,5% (w/v) акриламид: бисакриламид 19: 1, 1X трис/борат/EDTA (TBE), 0,05% (w/v) амониев персулфат (APS), TEMED 0,05% (w/v). Изсипете сместа между предварително излятите стъклени плочи, поставете гребена и оставете да се полимеризира за 30-60 минути при RT.
  3. След като гелът се полимеризира, прехвърлете устройствата в хладилника и в 1Х TBE за около 30-60 минути при 200-300 волта подаване.
  4. Добавете 1Х оцветител OrangeG (10mM Tris-HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 30% глицерин, 0.1% OrangeG) към всяка реакция. Пригответе проба с 2 nmol IP 6 като стандартно контролно натоварване.
  5. Измийте добре всяко кладенче с работещ буфер, като използвате спринцовка и 21G игла, за да отстраните всяка утайка, след което заредете гела. Избягвайте натоварването от страната на кладенеца.
  6. Пуснете гела през нощта при 450-550 волта (7 MAMP/гел), докато лентата за оцветяване OrangeG не е в рамките на последните 10 см от дъното на гела.

3. Изолиране на IP 7 - ден 3 (4 часа) и ден 4 (6-7 часа SpeedVac сушене)

  1. Демонтирайте апарата с гел и внимателно отстранете едната стъклена плоча, оставяйки гела върху другата. Нарежете малка част от гела точно над лентата за оцветяване OrangeG в долната част, използвайки стандарта IP-6 и пробна следа, както в илюстрация 1 показани.
  2. Оцветете изрязаната част от гела с толуидиново синьо (0,1% (w/v) толуидин синьо, 20% (w/v) метанол, 2% (w/v) глицерин) за няколко минути (1-3 минути) или нагоре се появява инозитол пирофосфатната лента. Поставете стъклената плоча обратно върху гела предварително, за да предотвратите изсъхването на неоцветения гел.

Обхватът на IP-7 трябва да бъде видим, тъй като работи малко по-бавно от стандарта IP-6. ATP, работещ по-бързо от IP 6, също трябва да бъде видим (Илюстрация 1). Прехвърлете оцветената част от гела в разтвор за оцветяване (20% (w/v) метанол) за няколко минути, измийте излишното толуидиново синьо и поставете гела с неоцветения гел.

Ако се изисква визуализация на по-високите пирофосфорилирани изоформи на инозитол (IP 8 и IP 9), оцветете гела с разтвор за оцветяване в толуидиново синьо за 20 минути при стайна температура. След това измийте толуидиновото синьо с разтвора за оцветяване за около 15 минути.

4. Определяне на концентрацията и чистотата на IP 7.

  1. Използвайте 2-5 μl от възстановената проба IP 7 върху гел с PAGE гел, подобно на раздели 2.2-2.5. Поставете множество разреждания на IP 6 (т.е. 0,5, 1, 2, 4 nmol) като стандарт за концентрация и 4 nmol поли-Р маркери. След пускане на гела, визуализирайте изоформите на инозитол пирофосфат, като оцветете и обезцветете целия гел с разтвор на толуидиново синьо, съгласно процедурата в раздел 3.2. (Фигура 2А) описано.
  2. След оцветяване с толуидин, концентрациите могат да бъдат определени чрез сканиране на гела и сравняване на разликите в интензитета между IP 6 и IP 7, като се използва софтуер за изображения като: Б. Изображение-J, както в Фигура 2Б показани.

5. Представителни резултати:

Подготвителното ензимно превръщане на IP 6 в 7 чрез IP IP 6 K1 и VIP1 ензимите може лесно да бъде отстранено с PAGE анализ (Илюстрация 1). Зареждането на IP 6 като контрол на размера заедно с оцветяването с толуидинов син гел дава възможност за идентифициране на пирофосфорилираните производни, тъй като те протичат по-бавно, в зависимост от броя на фосфатните групи на инозитоловия пръстен. Описаният по-горе метод позволява простото пречистване на IP 7. Анализът на пречистения инозитол пирофосфат чрез PAGE показа чистотата на нашия IP 7 (Фигура 2А). Интересното е, че 1/3PP-IP 5 изомерът на IP 7 продукт VIP1 мигрира малко по-бавно от 5PP-IP 5 изомера на IP 7, генериран от IP 6 K1. Използването на стандарти IP-6 позволява лесно количествено определяне на концентрацията на пречистения IP 7 (Фигура 2Б). Преди да се използва IP 7 за по-нататъшни експерименти, може да се оцени биологичната му активност
(Фигура 3). 5PP-IP 5 се инкубира с VIP1 и с IP 7 фосфатаза DDP1 (дифосфоинозитол полифосфат фосфохидролаза). Почистените IP 7 до IP 8 на VIP1 и IP 6 на DDP1 се почистват рутинно (Фигура 3) преобразуван.

протокол
Илюстрация 1:. Оцветяване с толуидин чрез PAGE и изолиране на IP 7-Band-Der Част от гела със стандарта (IP 6) се нарязва и се оцветява с разтвор на толуидиново синьо. Трите ленти представляват (отгоре надолу) IP 7, IP 6 и ATP. След това оцветената част от гела се подравнява с останалата част от гела. Това позволява локализирането на частта от гела с IP 7, която след това ще бъде изрязана и почистена (пунктирана кутия).

качествен
Фигура 2: PAGE анализ на реакционни продукти IP 6 K1 и VIP1. А) Използва се анализ на IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) с толуидиново синьо оцветяване за определяне на концентрацията на IP 7 както на IP 6 K1 (5PP-IP 5), така и на VIP1 (1/3PP-IP пречистен 5) ) Реакции. Б) Анализ на скатер диаграма за определяне на концентрацията на пречистения IP 7. Концентрациите се определят според интензивността на лентата, изчислена със софтуера ImageJ, в сравнение с предварително определени количества IP 6. Оста X представлява интензитет, оста Y представлява концентрации, изразени в nmol.

подготовка
Фигура 3: Анализ на биологичната активност на IP 7 За да определим качеството на пречистения IP 7, ние инкубирахме 5PP-IP 5 (IP 6 K1, генериран IP 7) с VIP1 или с IP 7 фосфатаза DDP1 и след това решихме да реагираме на PAGE. Оцветяването с DAPI и толуидин показа очакваното производство на IP 8 от VIP1 и превръщането на IP 7 в IP 6 от DDP1.

Дискусия

Използването на инозитол пирофосфат в биохимията е силно ограничено от търговската недостъпност на такива съединения и ниската чувствителност на съществуващите методи за откриване. Комбинацията от PAGE, която позволява разделянето на молекули, които имат различен брой фосфатни групи, и толуидиново синьо (Илюстрация 1), метахроматично багрило, което свързва фосфатни групи, позволява лесното откриване на изоформи на инозитол пирофосфат, отваряйки нови пътища в изследванията.

Описаното използване на технологията PAGE в инозитол пирофосфат за пречистване на продукти от ензимната реакция, проведена или от IP 6 K1, или от VIP1, е прост, икономичен и надежден метод, който позволява производството на големи количества висококачествен IP 7. Методът, описан по-горе, не се ограничава до простото пречистване на IP 7, но незначителни незначителни модификации на описания протокол могат да позволят пречистването на различен диапазон от инозитол пирофосфати. По-високите фосфорилирани инозитол пирофосфатни изоформи, с повече от осем фосфатни групи, биха могли да бъдат по-откриваеми с IP 7 или различни количества IP 6 от субстрата 20.6. Този инозитол пирофосфат може да бъде открит чрез увеличаване на дължината на цвета и след това пречистен (раздел 3.2). В допълнение, използването на IP 5 като субстрат за ензимната реакция би позволило пречистването на PP-IP 5 и други инозитол пирофосфати с хидроксилна група върху инозитоловия пръстен.

В резултат на това този неизискващ метод позволява надеждно пречистване на милиграмни количества инозитол пирофосфат с широко достъпни инструменти и по този начин отваря нови пътища за тази вълнуваща област на изследване.

Разкриване

Няма деклариран конфликт на интереси.

Благодарности

Благодарим на A. Riccio за полезни коментари и четене на ръкописа. Тази работа беше подкрепена от финансирането на Съвета за медицински изследвания (MRC) за звеното за клетъчна биология и от безвъзмездна помощ от Human Frontier Science Program (RGP0048/2009-C).