Откриване на геном на човешки метапневмовирус (hmpv) при хоспитализирани деца - Безплатен PDF
Откриване на геном на човешки метапневмовирус (hmpv) при хоспитализирани деца Встъпителна дисертация за получаване на докторска степен на Висшия медицински факултет на Рейнската академия на Фридрих-Вилхелмс-Бон Томас Бернд Глатцел от Бон 2008
Изготвено с одобрението на Медицинския факултет на Университета в Бон 1. Рецензент: Dipl.-Biol. Прив.-Доз. Д-р обратно нат. Оливер Шилдген 2-ри рецензент: проф. Д-р мед. Ден за устен преглед на Юрген Рокстрох: 27 октомври 2008 г. От Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Institute for Medical Microbiology, Imunology and Parasitology Директор: Проф. Д-р мед. Публикация на Achim Hörauf: Тази дисертация е публикувана по електронен път на университетския сървър за публикации на ULB http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.
Съдържание 0 Списък на съкращенията 7 1 Въведение 9 1.1 Парамиксовируси 9 1.1.1 Класификация 10 1.1.2 Структура 12 1.1.2.1 Вирусни частици 12 1.1.2.2 Геном и геномна структура 12 1.1.2.3 Вирусни протеини 14 1.1.3 Репликация 16 1.1.4 Парагрипни вируси 17 1.1.5 Вирус на заушка 19 1.1.6 Вирус на морбили 20 1.1.7 Респираторен синцитиален вирус (RSV) 23 1.1.8 Човешки метапневмовирус (hmpv) 25 1.2 Цел на работата 29 2 Материал и методи 30 2.1 Материал 30 2.1.1 Оборудване 30 2.1.2 Химикали 31 2.1 .3 Среда 32 2.1.4 Клетъчни култури 33 2.1.5 Основни разтвори 33 2.1.6 Буфери 34 2.1.7 Бързи тестове 34 2.1.8 Реагентни системи 35 2.1.9 Ензими 35 2.1.10 Нуклеотиди 35 2.1.11 Праймери 35 2.1.12 Стандарт на размера на ДНК 36 5
2.1.13 Плазмиди 36 2.1.14 Проби 36 2.2 Методи 37 2.2.1 Клетъчна култура 37 2.2.2 РНК екстракция от супернатант на клетъчна култура с помощта на RNeasy Protect Mini Kit 38 2.2.3 Полимеразна верижна реакция (PCR) 40 2.2.4 Гел електрофореза 45 2.2.5 Пречистване на PCR амплифицира с помощта на пречистващия комплект QIAquick-PCR 46 2.2.6 Клониране на PCR амплифицира с помощта на комплект за клониране TOPO TA 47 2.2.7 Секвениране на рекомбинантните плазмиди 50 3 Резултати 52 3.1 РНК-последващ буфер 52 3.2 Клетъчна култура 53 3.3 Оптимизиране на PCR 53 3.4 инфекции на hmpv и RSV 54 3.5 Разпределение по възраст 55 3.6 Сезонен курс 56 3.7 Симптоми и диагноза 57 3.8 Коинфекции 57 3.9 Случаи 58 3.10 Hmpv и отит на средното ухо 65 4 Дискусия 67 5 Резюме 71 6 Библиография 72 7 Благодарности 88 6
0 Списък на съкращенията: APV Птичи пневмовирус CMV CPE CRP CT Цитомегалия Вирус Цитопатичен ефект С-реактивен протеин Изчислена томограма ДНК dntps Дезоксирибонуклеинова киселина Деоксирибонуклеозид трифосфат Е. coli Ешерихия коли EDTA Етилендиамин тетраоцетна киселина ЕГЕ Ензим ецетна киселина Ецетна киселина Ецемен ецемент Ецетна киселина Ецетна киселина Ецетна киселина Ецетна киселина Ецетна киселина Ецетна киселина. и други FCS Фетален телешки серум GCS Глазгоу кома скала HBV HCV HHV hmpv HSV Хепатит В Вирус Хепатит С Вирус Човешки херпес Вирус Човешки метапневмовирус Херпес симплекс Вирус kb kd Килобази Килодалтон 7
LB mm mrna MRT Luria-Bertani Милимоларен пратеник-рибонуклеинова киселина Магнитно-резонансна томограма ND nm NS не се извършва Нанометър Неструктурен протеин PBS PCR Буфериран с фосфат физиологичен разтвор Полимеразна верижна реакция SDS SSPE Натриев додецил сулфат Субакутен склерозиращ паненцефалит РНК rVV µ RSV µ RSV µ RSV µ RSV µ RSV µ RSV µ RSV RS µm
Парамиксовирусите се характеризират със следните пет свойства: 1. Те имат отрицателно ориентирана едноверижна РНК, която се намира изключително в устойчива на РНКаза спирална нуклеокапсид, която също съдържа вирусна полимераза. 2. Транскрипцията се извършва в типичния режим стоп-рестарт. 3. Вирусната репликация се извършва в цитоплазмата. 4. Вирусните частици изискват липидна обвивка върху целевите клетки, за да се свържат там. 5. Вирусът прониква в клетката чрез сливане на вирусната мембрана с клетъчната мембрана (Collins et al., 2001) 1.1.1 Класификация Парамиксовирусите са класифицирани в две подсемейства: парамиксо- и пневмовирина. По-нататъшното разделение на родове и някои характерни представители е показано в Таблица 1. 10
Подсемейство Род животно Paramyxovirinae Respirovirus парагрипен вирус типове 1 и 3 говежди параинфлуенца вирус тип 3, Sendaivirus Rubulavirus паротит вирус, парагрипен вирус типове 2 и 4а, б кучешки параинфлуенца вирус тип 2, вирус Avulavirus нюкасълска болест, морбиливируси Muscle Virus, мускулни Stardust вирус, кучешки Stardustavirus -Petits- Преживни животни-Вирус Хенипавирус Хендравирус Нипахвирус Хендра Нипа Menangle Pneumovirinae Пневмовирус Респираторен говежди синцитиален вирус (RS- Респираторен вирус) Синциалиален вирус, Пневмониявирус на мишката Метапневмовирус Човешки ринотрахеит Вирус Човешки ринотрахит от Международния комитет по таксономия на вирусите през 2000 г. 11
2 Материал и методи 2.1 Материал 2.1.1 Инкубаторно оборудване: Инкубатор с газообразен CO 2, Heraeus, Hanau Incubator C200, Labotect, Meckenheim Електрофорезни камери: Модел B1, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Модел 41-1825, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Schüller: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH Rocking Platform, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Darmstadt Voltage devices: Power Supply Model 500/200, Bio-Rad Laboratories, Munich Power Supply Model 250/2.5, Bio-Rad Laboratories, Мюнхен Стерилни пейки: Herasafe, Heraeus Instruments, Hanau STERIL-ANTARES, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg T3 Thermocycler, Biometra GmbH, Göttingen Vortexer: Vortex-Genie2, Fisteher-Genie2, Fisteher-Genie2: PM 1200, Mettler Toldedo GmbH, Швейцария Водна баня: GFL 1038, Gesellschaft für Labortechnik mbh, Burgwedel Центрофуги: Biofuge 13, Heraeus Instruments, Hanau Cent rifuge 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30
2.1.2 Химикали Фирми, чиито химикали са използвани, са: Агароза Ampuwa Bacto-Agar Bacto-Tryptone Bacto Yeast Extract Boric Acid Bromophenol Blue Eagle s-minimal Essential Medium EDTA Ethanol Ethidium bromide Фетален телешки серум Калиев хлорид Калиев хидроген фосфат Натриев хлорид ди-натриев хидрогенфосфат трифосфат хлорид фосфат хлорид фосфат хлорид фосфат хлорид фосфат хлорид фосфат хлорид фосфат хлорид фосфат Трипсин/EDTA разтвор SeaPlaque GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc .; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg BiochG AG, Heidelberg KGaA Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Biochrom, Berlin Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Biochrom AG, Берлин 31
2.1.3 Media Eagle s Minimal Essential Medium Eagle s-mem-earle NaHCO 3 Добавяне на: Глутамин Пеницилин G Стрептомицин Фетален телешки серум Biochrom AG, Берлин 2,2 g/l 280 µg/l 40 U/ml 50 µg/l 10% (v/v) среда Luria Bertani (LB среда) с екстракт от дрожди Ampicillin Bacto 2,5 g Bacto-Tryptone 5 g NaCl 2,5 g Aqua dest. ad 500 ml Тази смес се автоклавира в продължение на 20 минути, съхранява се в хладилник при 4 ° С и се добавят 50 μg ампицилин преди инокулация. Плочи от агар на Luria Bertani (плочи от агар от LB) с екстракт от ампицилин Bacto дрожди 2,5 g Bacto триптон 5 g NaCl 2,5 g Bacto агар 6,25 g дестилирана вода ad 500 ml Тази смес се автоклавира в продължение на 20 минути, след като средата се охлади, се добавят 50 µg ампицилин и по 20-30 ml се поставят в чаша на Петри (Ø: 10 cm) и след това се съхраняват при 4 ° С в хладилника. 32
SOC среда (6 ml) триптон 2% дрожден екстракт 0,5% NaCl 10 mm KCl 2,5 mm MgCl 2 10 mm MgSO 4 10 mm глюкоза 20 mm 2.1.4 Клетъчни култури Vero-B4 клетки ATCC-ACC-33 LLC -MK2 клетки ATCC-CCL7 MS клетки, които не са изброени в ATCC MDCK клетки ATCC-CLL-34 RD клетки A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 Основни разтвори Ампицилин 50 mg/ml (H 2 O) EDTA (0,5 M) EDTA Aqua dest. титрува се до рН 8 с NaOH, автоклавира се 186,1 g и 1000 ml етидиев бромид 10 mg/ml 33
Буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Aqua dest. pH титрувано до 7.4 с HCl, автоклавирано 8 g 0.2 g 1.44 g 0.24 g ad 1000 ml 2.1.6 Буфер Tris-borate-EDTA буфер (TBE буфер 5x) Tris-алкална борна киселина EDTA ( 0,5M) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml ad 1000 ml 2.1.7 Бързи тестове RSV бърз тест RSV тест за грип Бърз тест RSV комплект, Directigen, Sparks USA Flu A + B тест комплект, Directigen, Sparks USA Използване на тези бързи тестове всяка проба, получена от пациенти с инфекция на горните и долните дихателни пътища, е тествана за грип и RSV. Резултатите от тези тестове са включени в раздела за резултати от тази работа. 34
2.1.8 Реагентни системи BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City USA Expand High Fidelity PCR System Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Германия One Step RT-PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden, Германия QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Хилден, Германия QIAquick-PCR-Пречистващ комплект Qiagen GmbH, Хилден, Германия RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Хилден, Германия Topo-TA Cloning Kit Invitrogen GmbH, Карлсруе, Германия 2.1.9 Ензимни ограничителни ензими EcoR1 Biolabs, Schwalbach, Германия ДНК полимераза Thermus aquaticus ДНК полимераза Roche Applied Science, Манхайм, Германия Thermus aquaticus ДНК полимераза Qiagen GmbH, Hilden, Германия Обратна транскриптаза Omniscript, Sensiskript Обратна транскриптаза Qiagen GmbH, Хилден, Германия 2.1.10 Нуклеотиди триоксисфеногеназин 25 nm) дезокситимидин трифосфат (25 nm) дезоксицитозин трифосфат (25 nm) дезоксигуанозин трип фосфат (25 nm) Roche Diagnostics GmbH, Манхайм, Германия 2.1.11 Грундове Четирите праймера са базирани на публикация на Viazov et al. (2003) взето. Следователно техните последователности съответстват на регион на N гена. 35
Всички грундове, използвани за тази работа, са произведени от Sigma, Deisenhoven. Последователностите, които сега следват, са отбелязани в посока 5 3. 111s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGRGATG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 ДНК стандартна дължина 1Kb Plus ДНК-Маркер, Mannheim, Манхайм на университетската детска болница Бон от 1 октомври 2001 г. до 31 март 2004 г. 1 октомври 2001 г. 30 септември 2002 г. n = 5 (не е включено в изследването) 1 октомври 2002 г. 31 март 2003 г. n = 300 1 октомври 2003 г. 31 март 2004 г. n = 332 n общо = 632 36
Целева последователност 1. Разделяне на веригата чрез нагряване до 95 С 2. Хибридизация с праймерите чрез охлаждане до 54 С 3. ДНК синтез чрез удължаване на праймерите при 72 С Фигура 2 PCR цикъл За умножаване на целевата последователност - тук оцветена в синьо - ДНК е Двойната спирала се стопи в двете единични нишки чрез нагряване до 95 ° C. За да може да се инициира ДНК синтез, праймерите, комплементарни на целевата последователност, първо трябва да се прикрепят. Това се случва, когато реакционната смес се охлади до 54 С. След това, като се започне от праймерите, ДНК полимеразата синтезира комплементарните нишки до единичните нишки на изходната ДНК. Този реакционен етап се провежда при 72 С. Тези етапи се повтарят няколко пъти и количеството на ДНК се увеличава експоненциално. 41
Вложен PCR Вложен PCR следва класически PCR. След като се репликира по-голяма част от ДНК, която съдържа целевата ДНК, тази секция се използва като шаблон за вложената PCR, в която се репликира по-малка част, която също съдържа целевата ДНК (вж. Фиг. 3.2). Тази процедура позволява повишаване на чувствителността и специфичността на PCR. В тази работа за вложената PCR е използвана PCR системата Expand High Fidelity PCR. Праймер от първи кръг Целева ДНК Праймер от първи кръг Праймер от първи кръг Първа транскрипция Праймер от втори кръг Специфичен ампликон на целевата ДНК Фигура 3 Вложен PCR Горната част на фигурата показва PCR (виж по-горе). Вторият раздел показва действителния вложен PCR. Праймерите, маркирани с праймери от втори кръг, са тези на вложените PCR. Те са по-близо до целевата ДНК, отколкото първоначалните праймери. Специфичните ДНК сегменти също се усилват тук, като се използват реакционни стъпки, както е описано по-горе за PCR. 42
52 ° С 30 секунди отгряване 72 ° С 1 минутно удължаване След тези цикли, крайното удължаване се извършва при 72 ° С за 5 минути. След приключване на този процес партидите се съхраняват при 4 ° С до по-нататъшна употреба. Реакционен подход на вложената PCR за hmpv За вложената PCR е използвана Expand High Fidelity PCR система от Roche, Mannheim. 10-кратен PCR буфер 5 µl dntps (100 mm) 3 µl ензимен микс 1 µl 114s праймер (25 pmol/µl) 0,5 µl 442as праймер (25 pmol/µl) 0,5 µl MgCl 2 (25 mm) 1 µl Без РНКаза вода 34 µl шаблон 5 µl 50 µl протокол на вложената PCR След първоначална денатурация при 94 ° C в продължение на 2 минути, 40 пъти се провежда следният цикъл: 94 ° C 30 сек денатурация 53 ° 30 сек отгряване 72 ° 45 сек удължаване Това е последвано от друг терминал Удължаване при 72 ° C в продължение на 5 минути и съхранение както в циклера, така и в хладилника при 4 ° C. Поредица от разреждания за оптимизиране на вложените PCR с добавяне на магнезий За разлика от тази на Viazov et al. (2003), предложен PCR протокол, магнезият е добавен към вложената PCR за стабилизиране в тази работа. 44
35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% 2002/2003 сезон 2003/2004 сезон общо hmpv RSV hmpv + rsv Таблица 6 Процентни дялове на RSV и hmpv или двойни инфекции от периодите 01.10.2002 до 31.03. 2003 (сезон 2002/2003), 1 октомври 2003 г. до 31 март 2004 г. (сезон 2003/2004) и за целия период (общо), въз основа на общия колектив от 300 или 332 пациенти от споменатите периоди. 3.5 Разпределение по възраст Възрастовото разпределение на инфекциите с hmpv доведе до следното разпределение: новородени (на възраст 4 седмици) n = 0 (0%), 5 седмици-5 месеца n = 16 (14.03%), 6-12 месеца n = 20 ( 17,54%), 13-24 месеца n = 21 (18,42%),> 24 месеца n = 31 (27,19%). Следователно повече от половината от заразените с hmpv пациенти са на възраст над 12 месеца и повече от една трета от пациентите са на възраст над 24 месеца. Възрастта е била неизвестна при 26 пациенти (22,8%). Възрастовото разпределение на данните е показано в таблица 7. 55
22.80% 27.19% 0% 14.03% 18.42% 17.54% до 4 седмици 5 седмици - 5 месеца 6-12 месеца 13-24 месеца в продължение на 24 месеца неизвестно Таблица 7 Процентно разпределение на възрастта на пациентите с hmpv -инфекция в периода 1 октомври 2002 г. до 31 март 2004 г. 3.6 Сезонен курс Картината, показана в Таблица 8, дава резултат за сезонното разпределение на инфекциите с hmpv. Няма ясно сезонно натрупване за началото на 2002/2003 година, докато през сезон 2003/2004 имаше ясен максимум през януари. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 октомври ноември декември януари февруари март април Таблица 8 Сезонна тенденция в броя на случаите на hmpv през зимните периоди 2002/2003 и 2003/2004 56
A Фигура 9 B T1-претеглено аксиално MRI изображение (A), коронален FLAIR (течност, атенюирана инверсия възстановяване) (B) на 14-месечен пациент с данни за hmpv. Значително увеличаване на сигнала кортикална и подкорова; интерпретирани като лезии в контекста на енцефалит (Schildgen et al. 2005). Осигурено от радиологичната клиника на университета в Бон. Фигура 10 CT изображения на същия пациент 2 дни след ЯМР. Хиподензни зони; тълкува се като признак на общ мозъчен оток (костен мозък и кора). Хипердензално натрупване в арахноидното пространство, което все още не е наблюдавано в ЯМР (Schildgen et al. 2005). Предоставено от радиологичната клиника на университета в Бон 61