Модел на самоограничено остро нараняване на белите дробове от едностранно протокол за вътрешно-бронхиална киселина

Обобщение

Селективното вливане на интра-бронхиална киселина в левия бял дроб при мишки води до универсално и самоограничено остро увреждане на белите дробове, което моделира синдрома на остър респираторен дистрес на човека (ARDS), предизвикан от аспирация на стомашна киселина.

Резюме

Селективното интра-бронхиално вливане на солна киселина (HCl) в левите бронхиални тръби на миши ствол причинява остро увреждане на тъканите с хистопатологични находки, подобни на синдрома на остър респираторен дистрес на човека (ARDS). Полученият алвеоларен оток, увреждане на алвеоларно-капилярната бариера и инфилтрация на левкоцити засягат предимно левия бял дроб, запазвайки десния бял дроб като невредим контрол и позволявайки на животните да оцелеят. Този модел на остро самоограничено увреждане на белите дробове позволява изследване на механизмите за разделителна способност на тъканите, като ефекроцитоза на макрофаги от апоптотични неутрофили и възстановяване на целостта на алвеоларно-капилярната бариера. Този модел е идентифицирал важни роли за агонистите на разделителната способност, включително специализирани медиатори за разрешаване (PMS), предоставяйки основа за разработването на нови терапевтични подходи за пациенти с RPS.

Въведение

Дисрегулирането на вродения имунен отговор по време на ексудативната фаза допринася за острото начало на ARDS и свързаната с него дихателна недостатъчност 1. Мощен провъзпалителен медиатор, сигнализиращ, организира първоначални имунни отговори, водещи до нарушаване на алвеоларно-капилярната бариера, дифузен алвеоларен оток и неутрофилна инфилтрация на мястото на увреждане на белодробната тъкан 4. При ARDS неефективните спирачни сигнали за остро възпаление предразполагат към белодробна недостатъчност и може да забави навременната катабаза на увредената белодробна тъкан.5 За тази цел предклиничното проучване на ендогенните механизми на иницииране и разрешаване на ARDS може да разкрие нови терапевтични стратегии. Такова изследване изисква самоограничени in vivo експериментални модели на остро нараняване на белите дробове, които много приличат на характеристиките на ARDS при хора, позволявайки разпит на механизмите, лежащи в основата на фазите на започване и разрешаване на увреждане на тъканите.

Представеният тук модел на мишка произвежда директни остри белодробни лезии, които демонстрират кардиналните патобиологични процеси на ексудативна ARDS, а именно нарушение на алвеоларно-капилярната бариера и инфилтрация на неутрофили. Методът разчита на селективното интра-бронхиално вливане на HCl чрез канюлиране на левия бронх на основния ствол, локализиране на нараняването и възпалителния отговор на левия бял дроб; неповреденият десен бял дроб може да се използва като вътрешен контрол за определени определяния на увреждане на тъканите и възпаление. Освен това едностранното увреждане на белите дробове не е фатално и показва програма за разрешаване. Това осигурява отделен прозорец в разрешаването на белодробното възпаление, който може да бъде използван за идентифициране на ендогенни про-решаващи клетъчни медиатори и механизми и за откриване на нови терапевтични пътища за ARDS, които наблягат на разрешаването на физиологията и фармакологията.

Протокол

Всички процедури, свързани с животни по-долу, са прегледани и одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните на Brigham и Болница за жени (Протокол № 2016N000356).

ЗАБЕЛЕЖКА: При всички процедури за оцеляване се спазва стерилна техника. За всяка операция се установява стерилна завеса с помощта на стерилна завеса, докато хирурзите носят стерилни хирургически ръкавици, шапки, маски и чисти лабораторни палта. Всички хирургически инструменти бяха стерилизирани с помощта на автоклав и стерилността беше поддържана с помощта на стерилизатор за топчета.

1. Приготвяне на 0,1 N HCI

2. Селективно интра-бронхиално вливане на HCl

3. Следоперативни грижи

  1. След като разрезът е затворен, поставете мишката върху лява страна върху топла нагревателна подложка, докато мишката се възстанови от упойка. Започнете да наблюдавате мишката за болка и ниво на активност, преди да я върнете в нормално състояние.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Бупренорфин трябва да се прилага подкожно 0,1 mg/kg на всеки 6-12 часа през първите 24 часа. Ако има постоянна пробивна болка, продължете обезболяващия режим, докато болката отшуми.

4. Бронхоалвеоларен лаваж на целия бял дроб (BAL) и имунофенотипиране на левкоцити

5. Оценка на пропускливостта на въздушната бариера с помощта на синьото багрило на Еван (DME)

  1. Инжектирайте синята боя на Evan (40 mg/kg) интравенозно 30 минути преди евтаназия.
  2. Евтаназирайте мишката, като използвате предозиране с кетамин/ксилазин (стъпка 4.1).
  3. За да измерите целостта на алвеоларната бариера, следвайте стъпки 4.2-4.9 за събирането на BAL.
  4. Прехвърлете 100 µl BALF в 96-ямкова микроплака на дъното, заедно със 100 µl дублирани стандарти за EBD. Използвайте PBS -/- като празно място.
  5. Използвайте четец на микроплаки, за да измерите абсорбцията на BALF при 620 nm и 740 nm. Използвайте абсорбция при 740 nm, за да коригирате замърсяването с хем в пробите 7 .
  6. За да се измери целостта на съдовата бариера, перфузирайте белите дробове чрез бавно инжектиране на 5 ml ледено студен PBS -/- през дясната камера на сърцето. Отстранете левия бял дроб.
  7. Изсушете левия бял дроб за 72 h при 58 oC, за да отстраните излишната вода.
  8. Третирайте изсушената белодробна тъкан както в Radu и Chernoff 2013 8 и измервайте абсорбциите при 620 nm и 740 nm.