Модел на мишка на протокол за частична обструкция на червата (преведен на немски)

Обобщение

Запушването на червата е частично или пълно запушване на червата, което може да причини силна коремна болка, гадене, повръщане и предотвратяване на преминаването на изпражненията. Този метод за създаване на частични чревни обструкции при мишки е надежден при изучаване на механизмите, лежащи в основата на патологичния клетъчен растеж и смърт в червата.

Резюме

Въведение

Непроходимостта на червата е частично или пълно запушване в тънките или дебелите черва, което предотвратява движението на храносмилателната храна, течности и газове през червата1. Поради запушването запушването предизвиква удебеляване на чревните стени, стесняване на лумена- 2. Запушване на червата може да възникне от коремна или тазова операция, която причинява коремна адхезия към подреждане на тъканите или от стомашно-чревни разстройства като възпалително заболяване на червата (болест на Crohn), дивертикулит, хернии, волвулус, стриктура, инвагинация, запек, фекална инфузия, псевдообструкция, рак и тумори 3, 4, 5. Чревните блокажи в тези случаи често водят до хипертрофия на tunica muscularis на червата 6 .

PO на лумена индуцира чревна експанзия и дебелина на гладката мускулатура около запушването в отговор на необходимостта от допълнително увеличаване на функционалната перисталтика 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. Животински модели на чревна PO са разработени за изследване на хипертрофия на гладката мускулатура при мишки 7, плъхове 10, морски свинчета 11, кучета 12 и котки 13, които постоянно развиват подобна хипертрофия в чревните мускулни слоеве.

Тук предлагаме миши протокол за чревна PO хирургия със силиконов пръстен. Надеждно получаване на PO хирургия Мишките произвеждат хипертрофия в tunica muscularis на тънките черва. В рамките на хипертрофичните мускули SMC, ICC, PDGFRα + и невроналните клетки са драстично преработени.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Следният протокол е одобрен от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Университета на Невада-Рено (UNR) за животински ресурси и отговаря на всички институционални етични насоки относно използването на лабораторни животни.

  1. Получавайте зрели (на възраст 4-6 седмици) мишки C57BL/6 с тегло между 20-30 g. Поставете колонията на лабораторни мишки в централизирана станция за животни в UNR Animal Resources.

(2) операция за частична обструкция

Забележка: Операциите се извършват в стая, посветена на хирургични интервенции. Всички хирургически инструменти са автоклавирани преди операцията. Стерилните хирургически рокли и ръкавици трябва да се носят от целия персонал в операционната през цялото време.

3,0 см коремен разрез по дължина със скалпел с острие № 15, за да се гарантира, че се врязва само кожата и да се избегне врязването в мускулно-перитонеалния слой в този момент. С помощта на форцепс и хирургически ножици внимателно отделете кожата от мускулно-перитонеалния слой, без да правите разрез, мускулно-перитонеалния слой. След като слоевете са достатъчно разделени (приблизително 1 cm x 4 cm), идентифицирайте linea alba в мускулно-перитонеалната равнина и изрежете

2 cm по линията alba, за да се разкрие интраперитонеалната кухина с микро форцепс и ножица.

  • Точно намерете и идентифицирайте приложението. Бавно и внимателно отстранете апендикса от интраперитонеалната кухина с микро-форцепс, изнесете проксималното дебело черво и илеума с апендикса навън върху стерилната завеса. Незабавно навлажнете чревната тъкан с 0,9% стерилна марля, напоена с физиологичен разтвор и поддържайте откритите тъкани постоянно навлажнени, докато са извън коремната кухина.
  • Намерете и идентифицирайте мезентериума между илеума и проксималното дебело черво. Направете разрез (

    3. Следоперативно наблюдение.

    1. След приключване на операцията преместете животните в инкубатор в стаята за възстановяване, където се регулират температурата и влажността. След операцията, наблюдавайте животните на всеки 15 минути за първия час, след това на всеки 30 минути за втория час, докато животните са в инкубатора.
    2. След като предписаното наблюдение приключи, преместете животните в собствената им клетка и ги наблюдавайте ежедневно за клинични индикации болка 18, и да се гарантира, че хирургичната рана присъства правилно, без никакви признаци на усложнения (заздравяването е дехисценция).

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    мишка

    Илюстрация 1: Частична чревна обструкция, индуцирана хирургично в модел на мишка. PO беше хирургично индуциран. Едномесечни мишки бяха анестезирани, коремът им беше отворен през разрез, силиконов пръстен беше поставен около илеума и отворът беше затворен чрез зашиване. На мишки, които са претърпели операция, е било позволено да се възстановят за 8 или 13 дни. Възраст и пол на SO мишки бяха оперирани по същия начин като PO мишките, с изключение на това, че нямаше съвпадение на пръстен. (А) Груби изображения на стомашно-чревния тракт при мишки, претърпели PO или SO операция. Снимките са на мишки на 8 и 13 ден след операцията (Б) Стомашно-чревният тракт, дисектиран от мишки в А. Тънките черва нагоре от пръстена бяха разтегнати на 8 и 13 дни след операция след PO, а фекалните пелети в дебелото черво също бяха по-малки както при 8, така и при 13-дневна операция, отколкото след PO след 13 дни след PO SO хирургични мишки поради частично обструктивния силиконов пръстен. Скалите са 0,5 cm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    протокол

    Фигура 2: Гладкомускулен слой, модифициран в хирургически модел на мишка. Представително H&E оцветяване на напречни сечения на илеума от чревни PO SO и без отглеждащи (NO) мишки. Слоевете на гладката мускулатура (SM) и лигавицата (Mu) са по-дебели PO мишки на 8 и 13 дни след PO операция от възраженията и без мишки. Скалите са 50 µm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    модел
    Фигура 3. Динамично ремоделиране на клетките при хипертрофия на гладката мускулатура в резултат на частична обструкция на червата. Представителни конфокални лазерни сканиращи изображения на хипертрофични илеални сечения от PO, т.е. и без мишки. -Белтъци, оцветени с антитела (червено) на MYH11 (SMC), KIT (ICC), PDGFRA (PDGFRα + клетки) или PGP9.5 (NC, невронни клетки), Co оцветени с DAPI (синьо). SMC в мускулатурата на лигавицата (MM), кръговия мускул (CM) и надлъжните мускулни слоеве (LM), както и PDGFRα + клетките в дълбоките мускулни сплетения (DMP), Auerbach региона (MY) и субсерозалната област (SS) нарастват в хипертрофичен илеум на 8 и 13 дни след PO хирургия при ICC в DMP, MY и SS, Auerbach plexus (MP), субмукозен сплит (SP), subserosal NC (SS) и ентерични двигателни неврони (EMN) бяха оттеглени. Скалите са 50 µm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    частична
    Фигура 4. Резултати от силиконови пръстени, които са твърде големи, твърде малки или не на място на дебелото черво. (А) в илеума няма да възникне хипертрофия на гладката мускулатура, ако пръстенът е твърде голям, за да причини запек. Пръстенът направи почти никакво запушване на илеума. (Б) чревна исхемия възниква в илеума, когато пръстенът е твърде малък. Пръстенът произвежда почти пълна блокада на илеума, която може да увреди тъканта и да доведе до ранна смърт, преди да се развие хипертрофия. (° С) Хипертрофия на гладките мускули в червата се развива поради фалшив пръстен. Пръстенът на дебелото черво е бил повреден от луменално съдържание (изпражнения), което се е движило надолу, увреждайки мезентериалната васкулатура и причинявайки масивно кървене в червата. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Ние показахме, че мишките, получаващи чревна РО хирургия, последователно и възпроизводимо развиват чревна хипертрофия на гладките мускули, която имитира чревна обструкция на човека. Операции за чревна непроходимост са разработени за различни животни като мишки 7, плъхове 10, морски свинчета 11, кучета 12 и котки 13. Моделът на чревната непроходимост при мишки има предимства във времето, цената, размера и фенотипа пред други по-големи животински модели. Развитието на хипертрофия при мишки или плъхове отнема само 10-14 дни 10, в сравнение с 2-4 седмици при морски свинчета, кучета и котки 11, 12, 13. Разходите за закупуване и поддържане на мишки също са огромна финансова полза в сравнение с други модели. Освен това, мишките са малки и лесни за използване за PO хирургия. Най-важното е, че мишките, получаващи PO хирургия, постепенно и широко развиват хипертрофия в тънките черва, докато други по-големи животни развиват по-малко екстензивен растеж.

    Този протокол за хирургическа операция се счита за основна операция за мишки. Всички хирургически инструменти и материали трябва да бъдат стерилизирани преди употреба, а операцията трябва да се извършва в чистата среда на специална операционна, за да се сведе до минимум замърсяването, което може да доведе до инфекция и възпаление при мишки. В допълнение, обезболяващо средство трябва да се дава на мишки след операция. Имаме версия с бавно освобождаване на бупренорфин, която е ефективна до 7-8 h-22. Освен това, след операцията, мишките имат затруднения с дъвченето и преглъщането на твърда храна. До 5 дни след операцията мишките получават мека храна (твърда диета с малко вода, добавена за омекотяване на храната) и преминават към нормална твърда храна след 5 дни.

    Нашата чревна PO хирургия осигурява in vivo модел на хипертрофия за чревна непроходимост, при който SMC, ICC и PDGFRα + клетки са необичайно преработени. Този PO модел е идеално подходящ и за разбиране как ентеричните неврони се променят от PO и как се засягат основните двигателни дейности в тънките и дебелите черва 23. Тези клетки могат да се възстановяват динамично при патологични условия, както и при култивирани условия 15, 16. Наблюдавахме, че тези клетки при SO мишки се държат малко по-различно от нормалните мишки без операция (Фигура 2 и Фигура 3). Повечето чревни непроходимости при хората се дължат на коремни сраствания, развити след операция, водеща до хипертрофия на гладките мускули 3, 4, 5, 21. След операцията SO също установихме, че SMC, ICC и PDGFRα + клетките са леко хипертрофични в тънките черва в сравнение с (Фигура 3), което предполага, че самата операция може да предизвика хипертрофия на чревните гладки мускули. Ако е така, SO хирургията не е пълен негатив за PO хирургия. Не и SO трябва да се използват като сравнение с PO червата.

    В обобщение, открихме ефективен/време ефективен, надежден и повторяем PO хирургичен протокол при мишки, които са създали здрави чревни обструкции. По време на развитието на уврежданията SMC, ICC, PDGFRα +, както и невроналните клетки се преработват динамично в различни тъканни слоеве и локали. Този in vivo модел на обструкция предлага нова представа за нашите знания за това как се случват фенотипни промени в запушени черва на клетъчно ниво.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.