Метод за производство на фоликулостимулиращ хормон, Патентна банка
Изобретението се отнася до ветеринарна медицина, по-специално до методи за производство на хормонални лекарства. При пречистване на крайния продукт, получен от хомогенизираната хипофизна жлеза на прасета, се извършва йонообменна хроматография и гел филтрация в присъствието на катионообменник CM-Sephadex при рН 5,6-5,7. Единицата за маса на крайния продукт по отношение на специфична активност е еквивалентна на дейността на фирма FSH Schering (САЩ) в съотношение 1,20 - 1,25: 1,2 таблица.
ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО КЪМ ПАТЕНТА
Изобретението се отнася до ветеринарна медицина, по-специално до методи за производство на хормонални лекарства.
Известен метод за получаване на протеинов хидролизат от тъканите на ендокринните жлези на животните чрез киселинна хидролиза на протеини, екстракция с ацетон, смес хлороформ: алкохол 2: 1. Полученият концентрат се обработва със солна киселина, хидролизира се, преминава през йонообменна смола и се изсушава (изд. St N 825083, клас A 61 K 37/02, 1981).
Известен е и метод за получаване на протеини от суровини от животински произход, включително екстракция на протеини от суровини със смес от хлороформ с метанол, измиване на екстракта, разтваряне и утаяване. Екстрактът се промива с 0,09-0,10% разтвор на натриев хлорид. Повторно разтваряйте протеините с органични разтворители. Те се утаяват с ацетон при съотношение на разтворител и ацетон 1: 5-1: 10 в продължение на 1-2 часа (изд. Ст. N 1080825, клас A 61 K 37/22, 1984).
Известните методи за извличане на протеини от животински тъкани обаче не могат да се използват при получаване на фоликулостимулиращ хормон от хипофизната жлеза на убити животни, тъй като екстрактът съдържа поне девет хормона, които контролират трофизма на други жлези, например ACTH, TSH, LH и др. (J. Buckle, Animal hormone, M. "Mir", 1986, стр. 9.27).
Освобождаването на всеки от хормоните изисква специфичен индивидуален метод, тъй като те се различават по своите специфични характеристики и различно молекулно тегло. За суперовулацията на женските говеда фоликулостимулиращият хормон (FSH), който е глюкопротеин, има биохимични и имунологични свойства, които се различават от свойствата на гонадотропин, получен от кръвта на бременни кобили (FFA). FSH няма полова специфичност, стимулира съзряването и растежа на фоликулите в яйчниците на женските селскостопански животни, образуването на фоликуларна течност и, когато се комбинира с лутеинизиращ хормон, насърчава образуването на естрогени в тялото на животните. Използва се при лечение на хипофункция при крави и юници, за индуциране на овулация при жени донори, използвайки технологията за получаване на ембриони. В тестисите на мъжки производители FSH стимулира развитието на сперматозоиди и началния етап на сперматогенезата, но не влияе върху хормоналната активност на тестисите на селскостопански животни (Ветеринарна енциклопедия. М. "Съветска енциклопедия", 1976, стр. 302 ).
Както се вижда от горното, FSH може да се използва широко и продуктивно в животновъдството и ветеринарната медицина. Изолирането му от хипофизната жлеза чрез екстракция с органични разтворители по известни методи е сложен, скъп процес и крайният продукт (FSH) обикновено е с ниска активност. Трябва да го купя от чуждестранни фирми.
Целта на изобретението е да подобри ефективността на целевия продукт.
Тази цел се постига от факта, че по време на пречистването на хормоналния препарат се извършва йонообменна хроматография и гел-филтрация в присъствието на катионообменника CM-Sephadex при рН-среда, равна на 5.6-5.7.
Катионообменник CM-Sephadex (карбоксиметилсефадекс) се използва при разделянето и фракционирането на основни протеини (Н. Кацимпулас. Йоннообменна хроматография. В книгата. Хроматография. Практическо приложение на метода. М. "Мир", 1986, с. 109 ). В научно-техническата литература, достъпна за нас, не е установено използването на CM-Sephadex при пречистването на FSH чрез йонообменна хроматография и гел-филтрация с pH-среда, равна на 5.6-5.7. Именно тези съществени характеристики на новия метод с двойно третиране с CM-Sephadex (в началото с гел, а след това и с прах) на хормонален препарат, получен от хипофизната жлеза на свинете, могат значително да увеличат специфичната активност и ефективност на използването на целевия продукт, беларуски FSH във ветеринарната медицина.
PRI me R (специфично изпълнение на метода). Прясно замразената хипофизна жлеза на свинете се хомогенизира, проба от 200 g се поставя в колба с вместимост 1500 ml, пълна с екстракционна смес, състояща се от 10% натриев ацетат или 60% амониев ацетат и 96% етилов алкохол на 40% от посочения капацитет, рН на разтвора се регулира до 5,7. Екстрахира се в хладилник при 0-5 около С за 12-15 часа с помощта на магнитна бъркалка. След това се центрофугира в центрофуга при 5000 об/мин. Изхвърлете супернатантата и измерете обема му. Към утайката се добавят 50 обема от същата екстрагентна смес, разклаща се и се екстрахира по същия начин за още 2 часа и също се центрофугира. Супернатантите се комбинират, смесват и се определя общият обем на екстракта, към който се добавят 4,6 l 83% етилов алкохол. Отработената утайка се изхвърля. Отлагането на FSH се извършва във фризер при -18 около С в продължение на 12-15 часа, след което прозрачната горна част на сместа се източва, а долната се центрофугира по гореописания начин и леката фракция на разтворът се взема отново. Утайката се обработва с 4-милимоларен разтвор на натриев ацетатен буфер в бидистилирана вода с рН 5,7. Обемът на разтвора е до 500 ml. Двукратното разтваряне на утайката се извършва в стъклена чаша в хладилник при температура 0-5 около С в продължение на 1-2 часа с помощта на магнитна бъркалка, след което се центрофугира отново, както е описано по-горе в продължение на 15 минути. Супернатантите се смесват и се добавят към предварително приготвения CM-Sephadex гел. Приготвя се, както следва: 10 g прахообразен CM-Sephadex се изсипва (500 ml) с ацетатен 4-милимоларен буфер. Зреенето на гела продължава 30 минути. След това излишната течност се източва.
Супернатантите в гела се смесват старателно със стъклена пръчка, последвано от разклащане и смесване на магнитна бъркалка в продължение на 2 часа при температура на околната среда 0-5 ° С. След това разтворът се филтрира през филтър на Seitz или през колона с гел филтрат при същата температура. Към получения филтрат се добавя отново 1 g CM-Sephadex, но вече под формата на сух прах, смесва се и се филтрира отново по същия начин. Вземете 500 ml филтрат, добавете 1 ml. тетрациклин за инжектиране и лиофилизиран до прахообразно състояние, около 48 часа, в алуминиеви тави при температура 0 ° С. Крайният продукт е сухо аморфно прахообразно вещество с бяло-сив или сиво-жълт цвят, разтворим в дестилирана вода или физиологичен разтвор за 1 мин. FSH е опакован във флакони от 10 ml от 150 mg, запечатани и етикетирани. FSH се съхранява при температура 2-4 o C. Срокът на годност на продукта е 2 години.
В същото време бяха проведени още два експеримента за получаване на беларуския FSH съгласно гореописания метод, но при различни pH-среди: 5.5 и 5.9. Всички останали параметри и последователността на действията на метода бяха същите като в горния пример за конкретно изпълнение на метода.
Специфичната активност за получаване на лекарства се определя по биологичния метод и способността да се стимулира растежа на яйчниците при инфантилни жени на фона на въвеждането на излишък от хориогонен гонадотропин (хориогонин) със сравнителен ефект на FSH с известната активност на компанията Шеринг (САЩ) върху подобни животни. Лекарствата се инжектират подкожно в продължение на 4 дни, два пъти на ден. Животните, които са получили инжекция с физиологичен разтвор, и същия брой животни, които са получили 40 IU хориогонин, са служили за контрол, тъй като всички експериментални животни са били лекувани с еднакво (40 IU) количество хориогонин преди въвеждането на различни дози FSH. Началната доза FSH е 0,25 mg, последвана от 0,5 и 1,0 mg. Четвъртата група животни са получили допълнителна доза FSH, получена в среда с рН равно на 5,5, 5,7 и 5,9, за да се установи еквивалентната маса на беларуския FSH Imu mg FSH от Schering за специфична активност.
Резултатите от изследването са показани в таблица 1. Данните показват, че специфичната активност на получените хормонални препарати е малко по-ниска от активността на внесения FSH от Schering от САЩ. Една масова единица внесен FSH представлява 1,20-1,25 масови единици беларуски FSH. FSH, получен в среда с pH 5.7, е по-активен в сравнение с FSH, получен в среда с pH 5.5 и 5.9 (71.8 ± 7.3 срещу 69.4 ± 7.2 и 68, 6 ± 7.0).
Сравнителна оценка на ефективността на употребата във ветеринарната медицина за предизвикване на суперовулация при женски говеда беше извършена в животновъдната ферма на конезавода Зарече, област Смолевичи, област Минск. Според доказаната технология за производство на ембриони, 39 крави са били лекувани с беларуски FSH. Група от подобни животни, лекувани със същата доза FSH, произведена от Schering, служи за контрол (Таблица 2).
Хормонално лечение на крави-донори се извършва съгласно стандартния четиридневен режим на инжектиране на FSH в доза 1200 IU FSH от беларуското производство, получена в среда с рН 5,7 и произведена от Schering.
По този начин специфичната активност на FSH, получена по предложения метод, използвайки среда при pH 5.7, е малко по-висока от тази на FSH, получена в среда с pH 5.5 и 5.9. Използвайки нов метод за получаване на беларуски FSH, човек може да се справи без оскъдното, скъпо внесено хормонално лекарство, което сега трябва да се плаща в чуждестранна валута.
ИСК
МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ФОЛИКУЛЕН ХОРМОН от хипофизната жлеза на животните, включително смилане на суровини и екстракция, характеризиращ се с това, че екстракцията се извършва в смес от 10% разтвор на натриев ацетат или амониев ацетат и 96% етилов алкохол, взети в съотношение 3: 2 по обем, в продължение на 12-15 часа при температура 0-5 o C, сместа се центрофугира и обработва с етилов алкохол, утайката се изхвърля, утаяването на целевия продукт се извършва при температура от -18 o C за 12-15 часа утайката се пречиства с помощта на CM-Sephadex два пъти: гел и прах, докато гелът се приготвя чрез смесване на прахообразен Sephadex с 4-милимоларен буфер на натриев ацетат или амониев ацетат в съотношение 1: 50 и се инкубира в продължение на 2 часа с продукта за пречистване при температура 0-5 o C, филтрира се и към филтрирания екстракт се добавят 2 mg вода. Ml прахообразен Sephadex, разбърква се в продължение на 1 час, филтрира се отново и се лиофилизира.