Клетъчно инженерство
Инженерство на растителни клетки
Основната задача на клетъчното инженерство е проектирането на нови растителни форми с желаните черти. Обещаващ метод за получаване на хибриди на далечни разстояния се основава на нова експериментална техника - парасексуална хибридизация, извършена чрез сливане на протопласти. Изследване на соматичната хибридизация чрез сливане на протопласт. Изследванията върху соматичната хибридизация на растенията вървят в три основни направления:
- изследване и реконструкция на плазмагени (генетичен материал, локализиран извън ядрото);
- изследвания за клетъчна хибридизация на филогенетично отдалечени растителни видове;
- производство на соматични хибриди чрез сливане на протопласти, които представляват практически интерес за развъждането.
Основните разлики между соматичната хибридизация и сексуалното кръстосване са както следва. Първо, с помощта на сексуална хибридизация, само растителни форми с нормална морфогенеза и гаметогенеза могат да се кръстосват. Пресиготичната несъвместимост може да бъде преодоляна с помощта на метода на сливане с протопласт. На второ място, половият процес е симетричен, тоест гаметите носят еднакви набори от ядрено генетичен материал от двамата родители до зиготата. Продуктите на сливане на протопластите често са асиметрични хибриди, представляващи ценни форми, съдържащи целия хромозомен набор от култивираните видове и само няколко хромозоми или гени на дивия родител. Трето, извънядреният генетичен материал в повечето растения по време на полово кръстосване се наследява строго в едно и също семейство - по майчина линия. Сливането на протопласти дава възможност да се получат уникални комбинации от митохондриални и хлоропластни гени. И накрая, четвъртата разлика е, че сексуалната хибридизация е възможна само между филогенетично близки растителни видове. Със соматична хибридизация е възможно да се получат хибриди от филогенетично отдалечени форми, които не могат да бъдат кръстосани по обичайния начин.
Сливането на протопласти започва с установяването на контакт (адхезия) между прасмалемите на съседните протопласти. В същото време има промяна в свойствата на мембраните, което води до тяхното сливане. Разширяването на локалните цитоплазмени мостове води до обединяване на цитоплазмите с образуването на хибридни клетки - кибриди.
За да се образуват от хибридни протопласти на растенията, протопластите трябва да се култивират, за да могат да се разделят и да образуват калус, от който впоследствие цялото растение може да се регенерира. Увеличава се броят на видовете, за които е завършен целият цикъл „Растение - протопласти - калус - растение“.
Един от най-важните моменти в соматичната хибридизация е отделянето на получените хибридни клетки от родителските. Изборът на парасексуални хибриди може да се извърши или на клетъчно ниво, или на етапа на регенерация на растенията. Селекцията на етапа на регенерация на растенията има редица съществени недостатъци, които усложняват такъв подбор: 1) няма сигурност, че всички хибридни растения не са потомци на една хибридна клетка; 2) дългото време, необходимо за избора на регенеранти; 3) висока интензивност на труда. В тази връзка се разработват методи за селекция на соматични хибриди на клетъчно ниво. Най-често срещаните методи са: 1) механична изолация; 2) генетично допълване; 3) физиологично допълване; 4) физическо обогатяване.
В популация от растителни клетки in vitro, след сливането им, могат да възникнат различни нежелани генетични промени (полиплоидия, хромозомни пренареждания, различни мутации), водещи до появата на форми, фенотипно подобни на хибридните. В допълнение, агрегирането на първоначалните родителски клетки може да доведе до образуването на химерни тъкани (растения). В тази връзка избраните форми на соматични хибриди трябва да бъдат подложени на допълнителни анализи, за да се провери тяхната хибридност. Хибридологичният анализ позволява оценка на F1 потомство след самоопрашване. Цитогенетичният анализ се основава на изследването на броя и морфологията на хромозомите на хибридни и родителски клетки. Методът за диференциално оцветяване на хромозомите е по-информативен. Цитогенетичният анализ се основава най-много на доказателства за комбинации от дълги разстояния - междуфамилни и междуплеменни.
Определянето на ензимната активност и изследването на спектъра на изоензимите дава възможност да се разкрие хибридната природа на изследвания материал. В същото време в спектрите на изозимите на хибрида трябва да се комбинират зоните, характерни за всеки от родителите. Физиологичната стабилност на различни форми на изоензими, в зависимост от диференциацията на клетките, използвани за анализ, е от голямо значение.