Характеризиране на молекулярните механизми на In vivo UVR индуциран протокол за катаракта (преведено на
Обобщение
Катарактата е водещата причина за слепота в света. Ултравиолетовото лъчение от слънцето (UV) е основният рисков фактор за развитието на катаракта. Разработен е животински модел на широко индуцирана от UVR-B катаракта. В тази статия ние описваме методи за изследване на развитието на катаракта: излагане на UV лъчение, количествена RT-PCR и имунохистохимия.
Резюме
Катарактата е водещата причина за слепота в света. Световната здравна организация определя катаракта като помътняване на лещата на окото, което затруднява пропускането на светлина. Катарактата е многофакторно заболяване, което включва диабет, тютюнопушене, UV лъчение (UVR), алкохол, йонизиращо лъчение, стероиди и хипертония. Има силни експериментални 2-4 и епидемиологични доказателства 5.6, че UVR причинява катаракта. Разработихме животински модел за индуцирана от UVR B катаракта както при анестезирани 7, така и при неанестезирани животни 8.
Единственият лек за операция на катаракта е, но това лечение не е достъпно за всички. Изчислено е, че забавянето на началото на катаракта за 10 години може да намали необходимостта от операция на катаракта с 50% 9. За да се забави появата на катаракта, е необходимо да се разберат механизмите на образуване на катаракта и да се използват ефективни стратегии за превенция. Сред методите за развитие на катаракта, апоптозата играе важна роля за индуцирането на катаракта при хора и животни 10. Наскоро се фокусираме върху апоптозата в лещата като механизъм за развитие на катаракта 8,11,12. Очаква се, че по-доброто разбиране на ефектите от UV лъчението върху апоптотичния път ще предостави възможности за откриване на нови лекарства за предотвратяване на катаракта.
В тази статия ние описваме как катаракта може да бъде предизвикана експериментално чрез in vivo излагане на UVR-B. Повече RT-PCR и имунохистохимията са представени като инструменти за изследване на молекулярните механизми на индуцирана от UVR-B катаракта.
Протокол
А. Излагане на ултравиолетова радиация
- 15 минути преди излагане, анестезирайте женски плъх Sprague-Dawley със смес от 90 mg/kg кеталар (кетамин) и 10 mg/kg rompun (ксилазин) чрез интраперитонеална инжекция.
- Поставете животното в ограничител на плъхове и издърпайте връзките до обездвижване на плъха без натиск 13.
- Инстилирайте мидриацил (тропикамид), 10 mg/ml, в двете очи на плъха, за да предизвика мидриаза.
- Поставете животното така, че едното око да е разположено срещу тесен лъч UVR при 300 nm 10 nm 14 с пълна ширина при половин максимум и да защитите контралатералното око с черно фолио.
- Поставете едностранно на плъховете на подпрагова доза от 1 kJ/m 2 UVR-B при 300 nm за 15 минути 15.
4. Имунохистохимично оцветяване
20 минути).
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Различните източници на вариации в измерванията бяха оценени с помощта на дисперсионен анализ и беше установено, че като се вземат предвид три измервания на животно, отклонението за измерванията е от порядъка на 15% от това за животните. По този начин, разглеждайки целия анализ на лещите, не е възможно да се увеличи точността. Ортогоналните тестове изчистиха статистически значима разлика за съобщението каспаза-3 между 120 часа латентност спрямо по-кратки интервали на латентност.
In vivo UVR излагането индуцира експресия на каспаза-3.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Тази статия описва методи, които позволяват изследване на молекулярните събития, предизвикани от катаракта по време на UVR-B.
Отбелязвайки, че по-голямата част от информацията за in vivo индуцирана от UVR катаракта е получена от експерименти върху плъхове албинос Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, решихме да включим плъха албинос Sprague-Dawley в текущо проучване за използване. Възрастта на плъховете беше на шест седмици. Полът е избран да бъде женски, тъй като за разлика от мъжете, женските имат по-малко алергенна урина. Освен това няма полова разлика в тежестта на индуцираната от UVR катаракта 20.
Всички животни са били отглеждани и лекувани съгласно декларацията на ARVO за използване на животни при офталмологични и зрителни изследвания. Етично одобрение беше получено от Комитета по етика на опитите с животни в Упсала, номер на протокол C 29/10. Плъховете се купуват от търговски животновъд (Taconic, Дания).
Палатка "> Избран е теснолентов UVR източник, така че UVR спектрално да се дефинира добре. Максималната чувствителност на лещата на плъх UVR-B е около 300 nm. Дозата 1 kJ/m 2 е избрана около праговата доза 15. Времето на експозиция от 15 минути е избрано, за да предизвика максимално увреждане на лещата 21. Дозата на експозиция на UV лъчение-B и след експозиция може да варира в зависимост от експерименталния дизайн.
Сдвоеното око на окото има своето предимство под формата на статистика и етика при използването на животни при изследвания. Едностранното излагане на окото може да използва едната страна като изложена, а другата страна като контрол при животно, така че намалява броя на животните наполовина в сравнение с несдвоения орган.
В този протокол използвахме анестезия като метод за обездвижване на животни. Но също така друга алтернатива може да се използва ограничител за плъхове 13, който ние разработихме в нашата лаборатория, за обездвижване на неанестезирани животни. Плъховете трябва да се кондиционират върху ограничителя на плъховете преди излагане на ултравиолетови лъчи. Това устройство също така позволява контролирана многократна експозиция, когато анестезията не се препоръчва поради нейните странични ефекти. Тук имаме ограничител за плъхове като позициониране и държач за обезболени животни.
Фиксаторът за плъхове е изработен от дърво и е в различни позиции в нашата лаборатория. Почистваме ограничителя си, преди всяко животно да е разположено върху него. Дървени блокове, улуци и дървени заслони се използват като обогатяване в клетките на плъхове. Това обогатяване е одобрено от Комитета по етика на експериментите с животни в Упсала и Федерацията на европейските лабораторни асоциации за научни животни (FELASA).
Лещата трябва да бъде подготвена в BSS за кратко време (5-10 минути). Това ограничение позволява лещата да остане ясна и прозрачна.
Времето от 30 минути за насочване на лещата в буфера за лизис RA1 е достатъчно, за да наруши капсулата и кората на лещата. Сърцевината на лещата остава твърда в рамките на 30 минути. Ядрото на лещата или свободната от органела зона се счита за неактивна част от лещата като транскрипционен фактор. Следователно, сърцевината ще бъде отстранена от пробата, за да се увеличи съотношението сигнал/шум - експресия на иРНК.
ДНК-специфичният праймер, използван за контрол на чистотата на РНК (без ДНК), е избран на случаен принцип, за да има р53 праймери. Всяка често срещана кодирана ДНК последователност, особено животински геном, може да бъде избрана. И двете цели бяха анализирани с PCR за 10 животни за интервал след експозиция и за всяка цел, съдържанието на каспаза-3 РНК беше определено в три независими измервания.
RT-PCR дава възможност да се измери mRNA от интерес. Обратната транскриптаза превръща mRNA в комплементарна ДНК, която след това се усилва чрез PCR. Измерванията се определят количествено, използвайки стандартната крива чрез усилване на серийно разредени проби от получената cDNA от intERest. Предимствата на използването на стандартна крива са, че стандартната крива осигурява надежден начин за изчисляване на несигурността на концентрацията и че стандартната крива осигурява количествени измервания на иРНК от интерес. Алтернативно, относителното съдържание на интересуващата иРНК може да бъде оценено чрез директно сравняване на броя на циклите, необходими за получаване на стандартизиран флуоресцентен сигнал, използвайки CT процедурата. Основният недостатък на калибровъчната крива е, че тя изисква използване на повече от генетичните продукти Ct метод.
Имунохистохимията е използвана за изследване на пространственото разпределение на активната каспаза-3 в епителните клетки на лещата.
Очите незабавно бяха замразени до -70 ° C, за да се спре всякаква продължаваща биохимия. След това очите се съхраняват при същата температура за съхранение.
Имунохистохимията е свързана с два общи проблема, специфичността на първичното антитяло и неспецифичното свързване на антитялото. Антителата трябва да бъдат получени от добре контролиран източник, като по този начин се гарантира специфичност. Ако е възможно, съдържащият тъкан епитоп трябва да бъде оцветен като положителен контрол. За да изпревари неспецифичното оцветяване Ако е възможно, епитопът трябва да бъде блокиран преди оцветяването със специфичното антитяло, отрицателна контрола. Освен това, неспецифичното оцветяване може да бъде сведено до минимум чрез оптималната концентрация на антитялото и времето за реакция. Чрез оцветяване както на тъкан, изложена на UVR, така и на тъкан, която не е изложена на UVR, е възможно да се получи индуцираният UVR епитоп, тук каспаза-3. За да се улесни броенето на клетките, които произвеждат сигнал каспапс-3, изображението на флуоресцентния микроскоп е записано цифрово. За да сведем до минимум вариациите във фоновия шум, имаме фиксирани настройки за всички микроскопични изображения.
Интензивността на фоновия флуоресцентен сигнал варира в непрекъснат мащаб. Следователно трябва да се определи праг за значително оцветяване. Средната флуоресценция обаче може да варира пространствено в рамките на наблюдаваната секция, което затруднява използването на абсолютен праг за значително замърсяване. Следователно обикновено преценката на конкретното оцветяване се основава на опитен наблюдател и абсолютният резултат, специфичен на оцветяването, зависи от мнението на опитния наблюдател, но ще бъде последователен за този наблюдател. Поради тази причина е използван само опитен наблюдател. За да се подобри това, причинено от експерименталната променлива експозиция на ултравиолетово лъчение в сравнение с шума, снимката на всяка секция е преброена три пъти.
Винаги когато е възможно, имунохистохимията трябва да бъде потвърдена с използване на Western blot за потвърждаване на съществуването на епитопи с очаквания молекулен размер.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.