Аеробна биогенеза на селенови наночастици от enterobacter cloacae z0206 в резултат на

субекти

абстрактно

В настоящото проучване изследвахме способността на Enterobacter cloacae Z0206 да намалява токсичния натриев селенит и механизма на този процес. Установено е, че E. cloacae Z0206 напълно редуцира до 10 mM селенит до елементарен селен (Se °) и образува селенови наночастици (SeNPs) при аеробни условия. Редуциращият селенит ефектор на клетката E. cloacae Z0206 трябва да бъде локализиран в мембраната ензим. Анализът на iTRAQ протеома показа, че селенитът индуцира значително увеличаване на експресията на фумарат редуктаза. В допълнение, както добавянето на фумарат към бульона, така и изключването на фумарат редуктаза (frd) значително намаляват скоростта на редукция на селенита, разкривайки неразпозната преди това роля на E. cloacae Z0206 фумарат редуктаза в редукцията на селенит. За разлика от това, реакциите, свързани с глутатион от Пейнтър, не са основният път към редукция на селенита. В обобщение, E. cloacae Z0206 ефективно редуцира селенита до Se °, използвайки фумарат редуктаза и образува SeNPs; Тази способност би могла да се използва за разработване на биореактор за третиране на примеси Se и за биосинтез на SeNPs в бъдеще.

Въведение

Доказано е, че намаляването на селенита до Se ° се медиира от тиоли (живописни реакции) в цитоплазмата като част от микробна стратегия за детоксикация 29. Селенитът реагира с GSH и образува селенодиглутатион (GS-Se-SG), който допълнително се редуцира до глутатион селеноперсулфид (GS-Se -) чрез NADPH-глутатион редуктаза. GS-Se - е нестабилен междинен продукт и претърпява реакция на хидролиза, за да образува Se ° и редуциран GSH. В допълнение към живописните отговори е съобщено, че редица терминални редуктази за анаеробно дишане, две нитритни редуктази, индуцируема сулфит редуктаза и фумарат редуктаза са способни да намалят селенита в клетки 30, 31, 32. 33 .

Доказано е, че Enterobacter cloacae SLD1a-1, дихателен селенат факултативен анаероб, катализира редукцията на селенат и селенит до Se ° 12, 34, 35 1, 5 mM). Доказано е, че редукцията на селенат е медиирана от мембранно свързан молибдоензим 36, 37, но механизмът на редукция на селенита в този щам не е изяснен. В допълнение, всички тестове за редуциране на селенит, включващи E. cloacae, са извършени в анаеробна среда и способността за редуциране на селенит на E. cloacae все още не е тествана при аеробни условия. Установено е, че E. cloacae Z0206, щам, който изолирахме от гъбата Рейши (Ganoderma lucidum) „месо“ 38, има отлична устойчивост на селенит и понася повече от 100 mM селенит. В настоящото проучване изследвахме (i) способността на E. cloacae Z0206 да редуцира селенит при аеробни условия, (ii) свойствата и местоположението на произведените SeNPs и (iii) механизма на редукция на селенита в щама Z0206.

Резултати и дискусия

Профил на растежа и редуцираща селенит способност на E. cloacae Z0206 при различни концентрации на селенит

аеробна

Растеж и намаляване на селенита на E. cloacae Z0206 в присъствието на различни концентрации на селенит. ( А. ) Очевидни промени в използвания бульон. ( Б. ) Профил на растежа при различни концентрации на селенит. Проби от 1 ml от бактериалната култура се събират на различни интервали от време за растеж на бактериите и след това се центрофугират в продължение на 10 минути при 4 ° С и 10 000 х g. Протеинът се екстрахира от гранулата с помощта на тестов комплект за пълна бактериална екстракция на протеин. Бактериалният растеж се измерва чрез количествено определяне на общия клетъчен протеин. Определя се концентрацията на протеин в бактериални клетъчни екстракти. ( ° С. ) Количество бактерии в момента във времето 96 часа. ( Д. ) Динамични промени в остатъка от селенит в бульона. ( Д. ) Кинетично изследване на редукцията на селенит от E. cloacae Z0206 при различни концентрации на селенит. Линейните диаграми и диаграмите са представени като средно ± SD, ** P

селенови

Характеризиране и локализация на SeNPs, синтезирани от E. cloacae Z0206. ( А. ) SEM изображение на E. cloacae Z0206 и SeNPs. ( Б. ) EDX анализ на съдържанието на въглерод, азот, кислород и селен в диапазона от ( А. ). ( ° С. ) Елементарен картографски анализ на разпределението на селен, въглерод, кислород и азот в диапазона от ( А. ). ( Д. ) TEM изображения на E. cloacae Z0206 и SeNPs. ( Д. ) EDX анализ на частици 1 и 2 в ( Д. ). ( F. ) Se 3D XPS с висока разделителна способност на пречистени SeNP, синтезирани от E. cloacae Z0206.

Редуциращата способност на селенита на различни клетъчни фракции от клетки на E. cloacae Z0206

наночастици

Редуциращ капацитет на селенит на различни фракции от E. cloacae Z0206. Редуциращата способност на селенита на бактерията се изчислява, като се използва следната реакционна смес: 100 µg протеин, 10 тМ селенит и 10 тМ NADH в 200 µl Tris-HCl (рН 7,5). Реакционната смес се инкубира при 37 ° С в продължение на 8 часа. Реакционната смес с цялата клетъчна фракция и без селенит служи като положителен или отрицателен контрол.

iTRAQ анализ на протеини E. cloacae Z0206 в отговор на селенит

Сред идентифицираните протеини селенитът индуцира 2,42-кратно увеличение на честотата на фумарат редуктаза (Таблица 1). Li et al. 33 показа, че редукцията на селенит в Shewanella oneidensis MR-1 се медиира от фумарат редуктаза, което показва, че фумарат редуктазата може да играе роля в процеса на редукция на селенит в E. cloacae Z0206. Най-очакваните антиоксидантни протеини, като глутатион синтетаза, глутатион редуктаза, глутатион дисулфид редуктаза, тиоредоксин, тиоредоксин редуктаза и тиоредоксин-зависима тиол пероксидаза, не показват значителни промени в отговор на лечението със селенит (вж. Таблица S2, Поддържаща информация).

Анализ на честотата на иРНК на избрани гени

За да се проверят резултатите от iTRAQ анализа, се оценява честотата на иРНК на ензима фумарат редуктаза (frd) и антиоксидантните ензими глутатион синтетаза (gsh A), глутатион редуктаза (gor), тиоредоксин (trx A) и тиоредоксин редуктаза (trx B). Както е показано на ФИГ.4, експресията на mRNA на gsh A, gor, trx A и trx B в клетките след стимулация от селенит не се различава от тази преди лечение със селенит. Лечението със селенит обаче насърчава експресията на иРНК на frd по начин, зависим от времето. Тези данни потвърждават, че E. cloacae може да редуцира Z0206 селенит до Se 0 чрез фумарат редуктаза вместо чрез реакция, медиирана от GSH от Painter.

enterobacter

Влияние на селенита върху транскрипцията на фумарат редуктаза и ензими, участващи в живописни реакции. Една нощна култура на E. cloacae Z0206 се коригира до OD 600 = 1 и се разрежда в прясна бульон (1%). Когато културата достигне стационарна фаза, се вземат 2 ml проба от културата (като Se-free контрол). След това 500 µm Добавя се 1 аликвотна част от основния разтвор на натриев селенит (1 М) и културата се инкубира за още 120 минути. Пробите бяха събрани 30 минути, 60 минути и 120 минути след добавянето на селенит. * Р

селенови

Влияние на BSO върху растежа и редукцията на селенит в E. cloacae Z0206. ( А. ) Растеж на E. cloacae Z0206 в присъствието на 1,5 тМ, 3,0 тМ и 5,0 тМ BSO. След това клетките се инкубират в присъствието на 5 тМ селенит с добавяне на 0 тМ, 1,5 тМ или 3,0 тМ BSO. Взети са проби по различно време за определяне на остатъци от селенит, а клетъчните проби са взети на 24 часа, 48 часа и 72 часа за измерване на вътреклетъчните концентрации на GSH. ( Б. ) Намаляване на селенита в присъствието на BSO. Резултатът се превръща в процент от първоначалната концентрация на селенит. ( ° С. ) Ефект на BSO върху вътреклетъчните концентрации на GSH. * P 33 съществува и фумарат редуктазата може да бъде основният път за редукция на селенит в E. cloacae Z0206.

биогенеза

Методи

Бактериален щам Z0206 и условия на култивиране

E. cloacae Z0206, щам, който преди това изолирахме 38, беше в оптимизиран бульон (захароза 25, триптон 5, екстракт от мая 5, K 2 HPO 4 · 3H 2 O 2, 62, KH 2 PO 4 1, MgSO 4 0,5 in) култивиран g L -1) при 32 ° C и 250 rpm.

Бактериален растеж при стрес на селенит

Ефектът на селенита върху растежа на E. cloacae Z0206 се определя в присъствието на 0 тМ, 0,5 тМ, 1 тМ, 5 тМ, 10 тМ и 15 тМ натриев селенит. Натриевият селенит се приготвя като 1 М основен разтвор и се стерилизира чрез филтриране. След това 500 ml колби на Erlenmeyer, съдържащи 100 ml бульон, бяха допълнени с нарастващи концентрации на селенит (0 тМ, 0,5 тМ, 1 тМ, 5 тМ, 10 тМ и 15 тМ) и бактериалната култура за една нощ беше намалена до OD 600 набор = 0,5 и инокулиран (1% размер на инокулума) в гореспоменатия бульон, съдържащ различни концентрации на селенит, последван от инкубация при 32 ° C, 250 rpm за 96 h.

Определяне на концентрацията на селенит

Културата се събира и центрофугира при 10 000 х g за 10 минути. Супернатантата се събира за откриване на остатъчен селенит чрез 2,3-диаминонафтален флуорометричен метод 41. Допълнителна информация за откриването на селенит може да се намери в раздел 1.2 под „Допълнителна информация“.

SEM и EDX анализ

Култури от Z0206 в присъствието на различни концентрации на селенит (0 тМ, 0,5 тМ, 1 тМ, 5 тМ, 10 тМ и 15 тМ) бяха събрани. Тези проби се центрофугират при 4 ° С и 12 000 х g в продължение на 15 минути и след това пелетите се измиват (0,1 М PBS), фиксират се, изсушават се и се разпръскват с покритие, последвано от наблюдение под SEM. Картите на съставния елемент на избрани области са анализирани със системата EDX.

TEM и EDX анализ

Култури от Z0206, отглеждани в присъствието на различни концентрации на селенит (0 тМ, 0,5 тМ, 1 тМ, 5 тМ, 10 тМ и 15 тМ) бяха събрани. Тези проби се центрофугират в продължение на 15 минути при 4 ° С и 12 000 х g и след това пелетите се измиват (0,1 М PBS), фиксират се, изсушават се и се влагат. Ултратънки срезове от 100 nm се изрязват и оцветяват, последвано от наблюдение под ТЕМ. Елементният състав на избрани частици беше анализиран с EDX система.

Вижте анализ на валентността на частиците

E. cloacae Z0206 се култивира в присъствието на 5 тМ селенит в продължение на 72 часа при 32 ° С и 250 rpm. Частиците на селен са получени от културата съгласно метода, описан от Dobias et al. Отделен разработен протокол. 42. с малко промяна. Накратко, културата се декантира, последвано от обикновено центрофугиране при 4 ° С при 8000 х g в продължение на 10 минути, за да се отдели суспендираната биомаса. Събраните частици Se, присъстващи в супернатанта от предишния етап на центрофугиране, се концентрират чрез центрофугиране при 4 ° С и 20 000 х g за 15 минути. След това пелетата се лиофилизира и анализира с помощта на XPS.

Разделяне на клетъчните фракции и определяне на редуциращата селенит активност

Култура от E. cloacae Z0206, отгледана до експоненциална фаза без селенит, се събира и центрофугира за 10 минути при 4 ° С и 10 000 х g. След това супернатантата се събира и филтрира с помощта на 0,2 цт филтър. След това, утайката се промива два пъти с 10 mM Tris-HCl (рН 7,5) и се суспендира отново в същия буфер за обработка с ултразвук, последвано от центрофугиране при 4 ° С при 6 000 х g за 10 минути, за да се отделят неразбити клетки. След това супернатантата се центрофугира при 4 ° С при 25 000 × g в продължение на 40 минути, за да се отделят цитоплазматичната (супернатанта) и мембранната (пелетна) фракция. Концентрацията на протеин се измерва с BCA комплект за анализ.

RT-PCR анализ

РНК се екстрахира с RNeasy Protect Bacteria Mini Kit. Общата РНК се подлага на реакция на обратна транскрипция, използвайки Quanti Tect комплект за обратна транскрипция. Количествената PCR се извършва със система за PCR в реално време StepOne Plus ™, използвайки FastStart Universal SYBR Green Master (ROX).

Определяне на вътреклетъчните концентрации на GSH

Клетки, събрани от експеримента върху "Ефект на BSO върху редукцията на селенит в E. cloacae Z0206" във времевите точки 24 часа, 48 часа и 72 часа, бяха концентрирани чрез центрофугиране при 10 000 × g, 4 ° С в продължение на 10 минути и се ресуспендира в 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), след което клетките се разрушават с помощта на ултразвук. Нарушените клетки се центрофугират при 20 000 х g в продължение на 15 минути и супернатантите се събират, за да се определи концентрацията на GSH, като се използва Total Glutathione Assay Kit.

Конструиране на Δ frd мутант

& Dgr; frd мутант е конструиран, както е съобщено другаде 43. Накратко, frd генният сливен фрагмент беше амплифициран и лигиран чрез PCR, след това лигиран с pLP12 и впоследствие трансформиран в Escherichia coli β2163. Получените плазмиди се въвеждат в E. cloacae Z0206 чрез конюгиране с E. coli β2163. След два кръга на селекция, мутантът, носещ изтрития frd ген, беше потвърден чрез PCR, като се използваха праймери, съответстващи на последователностите преди и след делецията (виж S4 в Допълнителна информация), и след това секвенирани.

статистика

Еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от LSD тест за многократно сравнение, беше използван за определяне на статистическа значимост за множество сравнения, а t-тестът на Student беше използван за двойни сравнения. P